Ингибирующее действие на днк человека что значит

Отряд самоубийц в медицине

Отряд самоубийц в медицине

Необратимый ингибитор (оранжевый), подобно диверсанту, подрывает работу фермента (синий). Это потенциальное лекарство против трипаносомы крузи — главной причины болезни сердца в Латинской Америке.

Авторы

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Многие лекарства конкурируют с природными молекулами за связывание со своей мишенью. Большинство таких препаратов связывается с белками за счет слабых взаимодействий, но некоторые способны образовывать прочные связи, «выключая» свою мишень до конца ее «жизни», пусть и ценой собственной. Такие лекарства относятся к классу необратимых ковалентных ингибиторов, получивших образное название суицидных ингибиторов (англ. suicide inhibitors). О них и пойдет речь в нашей статье. Как работают и насколько опасны одни из самых эффективных лекарств? Чья болезнь помогла открыть аспирин? Что общего между никотином и грейпфрутовым соком? Ответы на эти и многие другие вопросы вы найдете далее.

Конкурс «био/мол/текст»-2017

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2017.

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий и партнером номинации «Биомедицина сегодня и завтра» выступила фирма «Инвитро».

Из чего же, из чего же сделаны эти лекарства?

Сегодня сложно представить себе человека, который ни разу в жизни не принял ни одной таблетки. Каждый год прилавки аптек пополняются все новыми и новыми лекарствами. Независимо от цвета упаковки препарата и его лекарственной формы (будь то таблетка, мазь, капсула, раствор для инъекций и т.д.) внутри всегда содержится главный компонент лекарства — действующее вещество. Именно оно и обеспечивает терапевтический эффект.

Большинство действующих веществ является ингибиторами, то есть они блокируют функцию того или иного белка (чаще фермента, но иногда и рецептора) в нашем или чужеродном организме. Многие из них связываются со своей мишенью обратимо, то есть после встраивания в мишень молекула может выйти обратно, так что их возможности сильно ограничены. Но необратимые ковалентные ингибиторы «намертво» связываются со своей мишенью. В результате фермент больше не способен функционировать до тех пор, пока клетка не синтезирует его новые копии.

Низкомолекулярные «взломщики»

«В чем же секрет столь сильного связывания этих ваших необратимых ингибиторов?» — спросите вы. В ковалентной связи. Существует несколько механизмов связывания лекарств с их молекулярными мишенями. Обычно связывание происходит при помощи слабых взаимодействий [4]. Ковалентная же связь является сильнейшим из возможных взаимодействий и превосходит любые другие в десятки, а то и сотни раз (табл.1) [5]!

Таблица 1. Типы взаимодействий между ингибитором и рецептором. [5]

Тип связи	Энергия, ккал/моль
Ковалентная	50–150
Электростатическая	5–10
Водородная	2–5
Гидрофобная	0,5–1

Механизм образования ковалентной связи строится на том, что пара электронов одного из атомов молекулярной мишени (нуклеофила) распределяется между ним и одним из атомов ингибитора (электрофилом) (рис. 1). Из-за высокой прочности связи ингибитор оказывается необратимо присоединен к ферменту и приводит к разрушению последнего. Восстановление функции фермента наступает только после синтеза его новых копий [5].

Рисунок 1. Общий механизм действия необратимых ингибиторов.

Как же выглядят эти электрофильные группы, которые используются для создания ковалентных необратимых ингибиторов? Найти ответ вы сможете, посмотрев на рисунок 2. Наличие одного из этих фрагментов в структуре лекарства может говорить о том, что оно действует по уже известному вам механизму [6].

Рисунок 2. Примеры электрофильных групп, встречающихся в необратимых ингибиторах.

Несмотря на то, что связывание необратимых ингибиторов приводит к гибели фермента, не следует думать, что одна доза такого лекарства может полностью уничтожить фермент в организме. Наличие и работа генов позволит создать его новые копии, пусть на это и понадобится от нескольких часов до пары дней [2].

Как и все в мире, ковалентные необратимые ингибиторы имеют свои преимущества и недостатки, которые мы представили в формате таблицы 2 [6].

Таблица 2. Преимущества и недостатки ковалентных необратимых ингибиторов. [6]

Преимущества	Недостатки
Высокие эффективность и избирательность позволяют использовать меньшие дозы и уменьшить риск побочных эффектов	Высокая активность некоторых представителей может приводить к некрозу печени, мутациям и даже раку!
Связывание с важными остатками фермента предотвращает развитие устойчивости микробов, что важно при лечении инфекций	Потенциальная иммуногенность, так как полученный продукт реакции может вызывать аллергический ответ
Длительное действие, так как активность фермента вновь появляется только при синтезе его новых копий

Тернистые пути разработки эффективных лекарств

Если вы думаете, что разработка необратимых ковалентных ингибиторов — легкое дело, то вы глубоко заблуждаетесь. Даже если закрыть глаза на то, что разработка любого лекарства является крайне трудоемким и времязатратным процессом [7], задача не сильно упростится — ведь необратимые ингибиторы требуют особого подхода к своей персоне. Сегодня не так много одобренных препаратов действуют именно таким образом. А механизм действия многих из них открыли только спустя годы после разработки! Ученые на этом пути сталкиваются с большим количеством порой неразрешимых проблем.

Одна из них — участие одного фермента сразу в нескольких метаболических каскадах. Обсуждаемые лекарства необратимо связываются с ферментом-мишенью, уничтожая его на то время, которое требуется на синтез новых копий фермента. Этот процесс может занимать до нескольких суток! В том случае, если фермент-мишень выполнял несколько функций, это чревато серьезными побочными эффектами. Чтобы обойти проблему, необратимо связывающиеся ингибиторы чаще всего применяют для блокирования одного из ферментов потенциально опасных для человека вирусов, бактерий и т. д. [3].

Вторая проблема заключается в том, что при низкой избирательности необратимые ингибиторы могут связываться с нежелательными мишенями, похожими на выбранную нами для ингибирования. Это тоже может приводить к серьезным побочным эффектам. Поэтому важная задача при оптимизации структуры ингибиторов — повышение избирательности к своей мишени [3].

Опасения в отношении побочных эффектов необратимых ингибиторов не лишены оснований. Бум гонений на эту группу препаратов вызвали исследования 1970-х годов. Тогда выяснили, что два из наиболее широко известных представителей этой группы — парацетамол и фуросемид — обладают высокой токсичностью в связи с тем, что, метаболизируясь в печени, они образовывают активные производные, формирующие ковалентные связи с ее белками [2], [8]. Как выяснилось позже, эти единичные случаи не имеют отношения ко многим препаратам из группы необратимых ингибиторов, а парацетамол и фуросемид до сих пор активно используются в клинической практике.

Другим распространенным примером нежелательного необратимого ингибирования является цитохром P450. Цитохромы — группа ферментов в нашем организме, главной задачей которых является обезвреживание потенциально опасных веществ. Первыми необратимыми ингибиторами цитохрома стали алкены и алкины. В результате ингибирования этого фермента процессы детоксикации становятся невозможными. Неполный список препаратов, способных вступать в подобную реакцию, включает 17α-алкенил-стероиды, левомицетин, циклофосфамид, спиронолактон, фурокумарины, никотин, изониазид и барбитураты. Звучит опасно, не правда ли? Не многим опаснее, чем пить грейпфрутовый сок! Его компоненты способны необратимо связываться с цитохромом кишечника и лишать этот фермент активности на 24 часа! К чему это может привести? К тому, что принимаемые в это время лекарства будут более эффективно поступать в наш организм, а рост их концентрации повышает риск развития нежелательных эффектов [5]. Именно поэтому врачи рекомендуют запивать таблетки только водой.

Но всегда ли можно считать необратимые ингибиторы безопасными лекарствами? Конечно же, нет. Поиск необратимых ингибиторов, и правда, не всегда оборачивается успехом для исследователей. В частности, полным провалом завершились исследования мышьяк-содержащих органических соединений для лечения трипаносомоза [9]. Эти соединения необратимо ингибировали жизненно необходимые ферменты трипаносомы за счет образования связей между атомом мышьяка в составе исследуемых веществ и серосодержащими остатками фермента. Но они оказались токсичными не только для трипаносомы, но и для организма человека [5].

К счастью, несмотря на все перипетии судьбы, ученые вновь сфокусировали свои пристальные взгляды на необратимых ковалентных ингибиторах. Лучшее понимание реально существующих рисков и знание механизма химических преобразований открыли множество возможностей для разработки более эффективных лекарств и привели к резкому росту встречаемости необратимых ингибиторов в различных исследованиях [10].

«Ветераны» борьбы за здоровье человечества

Многие из широко применяемых успешных препаратов — необратимые ковалентные ингибиторы [6]. Например, в 2009 году три необратимо связывающихся ингибитора попали в топ-10 наиболее продаваемых лекарств [2]. В 2011 году из 39 ковалентных лекарств, одобренных в США, 33% являлись противоинфекционными, 20% нашли применение в лечении рака, 15% применялись при болезнях пищеварительного тракта, 10% — при нарушении работы центральной нервной системы, 5% использовались при лечении сердечно-сосудистых заболеваний и один препарат обладал противовоспалительными свойствами (рис. 3) [6], [11].

Рисунок 3. Области применения одобренных в США необратимо связывающихся ингибиторов (данные за 2011 год).

Рисунок 4. Структура салицилата натрия (а) и аспирина (б).

Давайте же поговорим о нескольких наиболее успешных примерах необратимых ковалентных ингибиторов.

Натрия салицилат впервые применили в качестве противовоспалительного лекарства в 1875 году (рис. 4а). Препарат обладал ужасным вкусом и вызывал язвы ротовой полости и желудка. В конце XIX века отец одного из химиков компании Bayer Company, страдающий от тяжелого ревматоидного артрита, упросил своего сына, Феликса Хоффмана, заняться поиском менее опасного аналога салицилата натрия. Феликс синтезировал различные производные и обнаружил, что ацетилсалициловая кислота обладает лучшими свойствами. Так был обнаружен аспирин (рис. 4б). В 1899 году Bayer выпустила аспирин как противовоспалительное, обезболивающее и жаропонижающее средство [2]. Как и в случае многих других препаратов, механизм его действия открыли только спустя 70 лет после коммерциализации препарата [6], за что в 1982 году была вручена Нобелевская премия [2], [12]. Аспирин оказался необратимым ингибитором ферментов, участвующих в реакции воспаления — циклооксигеназ [6].

Рисунок 5. Структура пенициллина.

Другие примеры необратимых ковалентных ингибиторов — пенициллины [6]. Их родоначальника, пенициллин (рис. 5), открыл в 1928 году Александр Флеминг [13]. Ученым понадобилось еще 15 лет, чтобы достаточно изучить и начать использовать этот препарат в качестве антибактериального лекарственного средства, что спасло миллионы жизней во время Второй мировой войны [12]. Пенициллин нарушает синтез клеточной стенки бактерий. Он связывается с транспептидазой — ферментом, обеспечивающим первый этап сшивки пептидогликана, который является основным компонентом бактериальной клеточной стенки. Когда пенициллин связывается с транспептидазой, синтез бактериальной клеточной стенки блокируется, и многие бактерии погибают от разрыва клеточной мембраны под воздействием осмотического давления [1].

Однако все оказалось не так радужно — у бактерий обнаружились механизмы устойчивости [14]. В частности, резистентность к пенициллинам обеспечивается за счет наличия β-лактамаз — ферментов, расщепляющих пенициллины. Ученые не остановились на достигнутом и разработали ингибиторы этого фермента — сульбактам, тазобактам и клавулановую кислоту. Подобно пенициллинам, в результате нуклеофильной атаки эти соединения претерпевают открытие β-лактамного кольца. Отличие в том, что ингибиторы β-лактамаз подвергаются раскрытию и второго цикла, содержащегося в их структуре. При этом появляется возможность образования дополнительных связей, в том числе и ковалентных (рис. 6) [6], [15].

Рисунок 6. Механизм действия ингибиторов β-лактамаз

Рисунок 7. Структура ацикловира.

Ацикловир — один из самых эффективных препаратов с противовирусной активностью (рис. 7). Он был открыт в 1974 году крупной ныне фармацевтической компанией — GlaxoSmithKline (тогда она называлась Burroughs Wellcome) — в ходе широкомасштабного поиска противовирусного средства, начавшегося еще в 1960-е годы. А в 1988 году за изучение механизмов действия ацикловира и других препаратов вручили Нобелевскую премию [16].

В клинической практике ацикловир применяют для лечения вируса герпеса. Важно, что здоровые клетки человека не подвергаются действию препарата. Ведь ацикловир попадает в клетку благодаря одному из ферментов вируса — тимидинкиназе! Способность ацикловира связываться с этим ферментом в 200 раз выше, чем с любым ферментом нашего организма. Оказавшись в зараженных клетках, ацикловир преобразуется в ацикловир трифосфат, который связывается с вирусной ДНК и в таком виде необратимо ингибирует вирусные ДНК-полимеразы, необходимые для размножения вируса [17].

Другим широко известным примером необратимых ингибиторов является омепразол, одобренный к применению в 1980-х. Его применяют при заболеваниях пищеварительной системы, сопровождающихся усиленным выделением желудочной кислоты, таких как изжога или язва желудка. В нейтральной среде омепразол не оказывает действия на наш организм, но при ее закислении желудочным соком необратимо связывается с протонной помпой, ответственной за образование кислоты в желудке. Это происходит потому, что благодаря кислой среде омепразол претерпевает ряд внутримолекулярных перестроек и становится способным принять на себя нуклеофильную атаку каталитического цистеина протонной помпы, тем самым образуя прочную ковалентную связь и выключая этот белок (рис. 8) [6], [18], [19].

Рисунок 8. Механизм действия омепразола.

Африканская сонная болезнь, или африканский трипаносомоз, вызывается простейшими рода трипаносома. До конца XX века эта болезнь была практически неизлечима. Вакцины оказались неэффективны против трипаносом из-за того, что последние имеют механизмы обхода иммунной системы человека. Поэтому, основываясь на знаниях о жизненно необходимых ферментах этих простейших, ученые прибегли к разработке механизм-опосредованно связывающихся ингибиторов. Ахиллесовой пятой в метаболизме трипаносом оказался путь биосинтеза полиаминов, вовлеченных в процессы упаковки ДНК и в больших количествах необходимых при делении клеток. Первый этап их синтеза обеспечивает фермент орнитиндекарбоксилаза при участии вспомогательной молекулы — витамина В6. В клетках млекопитающих фермент синтезируется быстро, а у трипаносом этот процесс занимает гораздо больше времени. Именно поэтому необратимые ингибиторы орнитиндекарбоксилазы мало влияют на человеческие клетки, но крайне губительно действуют на паразита [1]. На базе этого механизма был разработан дифторметилорнитин (ДФМО). ДФМО достаточно инертен в растворе, но в результате реакции с витамином В6 приобретает способность связываться с орнитиндекарбоксилазой, которая быстро инактивируется (рис. 9). Эта реакция необратима. Таким образом ДФМО использует собственные реакции фермента для его уничтожения. Препарат показал высокую эффективность против африканской сонной болезни в клинических исследованиях и используется в настоящее время для ее лечения [1].

Рисунок 9. Комплекс производного ДФМО (голубой) с витамином В6 (зеленый) и ферментом орнитиндекарбоксилазой (серый).

А недавно ученые обнаружили, что ДФМО также может использоваться в качестве препарата против рака! Механизм действия ДФМО по отношению к раковым клеткам хорошо изучен. Так же, как и в случае лечения трипаносомоза, этот агент ингибирует действие орнитиндекарбоксилазы. Ведь, что интересно, в опухолевых клетках количество этого белка значительно выше, так как они интенсивно делятся! При инактивации орнитиндекарбоксилазы в раковых клетках падает уровень полиаминов, что нарушает правильную упаковку ДНК, в результате чего клетки перестают делиться. Этот эффект препарата называется цитостатическим. Однако если препарат применять долго, то происходит не замедление деления, а гибель раковых клеток! ДФМО сам по себе не обеспечивает достаточный противораковый эффект, но в комбинации с другими химиотерапевтическими препаратами этот компонент показал увеличение выживаемости пациентов и ускорение темпов выздоровления. Поэтому ДФМО имеет потенциал применения в качестве лекарства, предотвращающего возникновение онкологии, либо снижающего вероятность рецидива рака после удаления опухолевых клеток [20].

Есть ли будущее у необратимых ковалентных ингибиторов?

Долгие годы необратимые ингибиторы были окружены аурой скептицизма, возникшей из-за токсичности некоторых представителей этой группы, обнаруженной в 1970-е годы. Но эффективность и избирательность многих препаратов этой серии доказали, что страхи в их отношении не были оправданными. Конечно, они обладают потенциальной опасностью из-за возможности неспецифических взаимодействий и аллергических реакций, но клиническая практика показывает их незаменимость в лечении целого ряда заболеваний. Сейчас число препаратов этой группы неуклонно растет [6].

Сложность в том, что исследователь должен преследовать сразу несколько целей: повысить избирательность лекарства к ферменту-мишени и тщательно продумать механизм его действия. Но такие свойства необратимых ковалентных ингибиторов, как высокие избирательность и эффективность, высокая продолжительность действия, сниженный риск развития устойчивости к препарату, делают эту группу лекарств незаменимым инструментом в арсенале врачей и разработчиков лекарств [6].

Источник

Фавипиравир: скрытая опасность мутагенного действия

Полный текст:

Аннотация

Антивирусный химиопрепарат фавипиравир (ФП) имеет свойства функционального конкурента гуанозина и аденозина, в инфицированных клетках претерпевает химическую трансформацию ферментами клетки в нуклеотидную форму — ФП-рибозилтрифосфат, который способен связываться с вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой и встраиваться в цепочку вирусной РНК, вызывая заметное мутагенное действие посредством транзиций в геноме РНК-содержащих вирусов, преимущественно G→A и C→U. Усиление синтеза мутантных форм вирионов под действием ФП, помимо вирусингибирующего эффекта, несет угрозу появления новых опасных вирусных штаммов с повышенной патогенностью для человека и животных и приобретённой устойчивостью к химиопрепарату. Для минимизации мутагенного эффекта ФП возможны синтез новых модификаций ФП, лишенных способности встраиваться в молекулу синтезированной РНК; комбинированное применение ФП с противовирусными химиопрепаратами иного механизма действия и направленными на различные вирусные и/или клеточные мишени; курсовое применение при строгом врачебном контроле высоких терапевтических доз ФП для усиления летального мутагенного эффекта на инфекционный вирус в организме-реципиенте для предотвращения размножения его мутантных форм.

Ключевые слова

Введение

Хорошо известно, что вирусы являются облигатными паразитами, полностью зависимыми от организма-хозяина. Это свойство вирусов существенно затрудняет создание и поиск лекарственных средств, которые способны специфически ингибировать вирус, но при этом не оказывать вредного воздействия на биохимические процессы макроорганизма-хозяина. Данное обстоятельство является главной причиной ограниченности арсенала активных противовирусных препаратов. Пандемия COVID-19 еще раз обнажила данную медицинскую проблему, поскольку на сегодня в медицинской практике практически отсутствуют специфические лекарства против данного коронавируса.

На текущий момент можно выделить 6 главных направлений разработки лекарств в отношении коронавирусов:

1) ингибиторы вирусной полимеразы;

2) ингибиторы вирусной протеазы Мpro, участвующей в формировании активной полимеразы вируса;

3) ингибиторы клеточных протеаз, участвующих в активации вирусного белка S, регулирующего вход вируса в клетку-мишень;

4) ингибиторы депротеинизации вируса в клеточных эндосомах;

6) препараты, созданные на основе противовирусных антител [1][2].

В каждом из перечисленных направлений ведутся интенсивные исследования по поиску и созданию эффективных лекарств противовирусного действия.

В последний год в связи с поиском и созданием химиопрепаратов против COVID-19 пристальное внимание обращено на лекарства из первой группы — ингибиторы вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (RNA dependent RNA polymerase — RdRp). В частности, надежды возлагают на вещество, получившее название фавипиравир (ФП) — 6-фтор-3-гидрокси-пиразинкарбоксамид [3][4]. Данное вещество было синтезировано и запатентовано японскими учеными Y. Furuta и H. Egawa в конце 1990-х гг. [5]. Последующие исследования показали, что данное соединение обладает высокой активностью в отношении большой группы вирусов, включая РНК-содержащие вирусы, такие как вирусы гриппа, бунья-, арена-, флави-, пикоранавирусы и др. Серьёзным недостатком ФП является его выраженная побочная токсичность для реципиентного макроорганизма, которая обусловлена тератогенными и эмбриотоксическими свойствами препарата [6][7]. По этой причине в мировой практике ФП разрешён к ограниченному применению при строгом врачебном контроле при угрожающем течении гриппа или COVID-19.

По структуре ФП имеет заметное сходство с нуклеозидами и функционально конкурирует с гуанозином и аденозином (рис. 1), обладая способностью связываться с вирусными РНК-полимеразами и ингибировать их функцию [8]. Поскольку РНК-полимеразы многих вирусов имеют консервативную структуру и сходный механизм катализа [9][10], ФП, нарушая специфическую функцию RdRp, обладает активностью в отношении широкого круга РНК-содержащих вирусов [4][8][11]. Однако в последнее время появились сообщения о наличии вирус-специфичных различий связывания ФП в области нуклеотид акцепторного центра у РНК-полимераз различных вирусов [12].

ФП как аналог гуанозина эффективно распознается и модифицируется клеточными ферментами, в частности гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазой (HGPRT), посредством присоединения остатка рибозы (рибозилирования) [13–15]. Образовавшийся ФП-рибозилфосфат претерпевает дополнительное фосфорилирование рибозильного остатка, приобретая свойства нуклеозидтрифосфата (ФП-рибозилтрифосфата — ФПРТФ) и способность встраивания в цепочку вновь синтезируемой молекулы вирусной РНК посредством вирусной RdRp [16][17]. Встраивание нуклеозидных аналогов в вирионную РНК затрудняло и нарушало комплементарное спаривание оснований при матричном синтезе цепочек РНК вирусной полимеразой.

Во-первых, ФП-зависимое затруднение спаривания оснований вызывало преждевременную терминацию синтеза цепей РНК и образование коротких дефектных фрагментов вирусных РНК [18][19].

Во-вторых, встраивание ФП в синтезируемую новую цепь РНК происходило с нарушением уотсон-криковского спаривания и приводило к мутациям (транзициям), преимущественно двух типов: G→A и C→U [8][16][20–22]. Частота таких ошибок в вирусных РНК в инфицированных клетках возрастала с увеличением концентрации ФП в питательной среде. При этом уровень мутаций, особенно транзиций G→A и C→U, в вирусных РНК возрастал в 3–12 раз в инфицированных клетках, инкубируемых с ФП, и достигал уровня 10–1 мутаций/нуклеотид в вирусном геноме при концентрации ФП 500 мкМ [23]. Подавляющая часть мутированных молекул РНК была нефункциональной, что оказывало летальное мутагенное действие на размножение вируса, т.к. нарушало образование полноценного инфекционного вируса и приводило к формированию неинфекционной вирусной популяции и заметному снижению инфекционного процесса [24][25]. В результате ФП-индуцированного мутагенного действия развивался так называемый абортивный тип вирусной инфекции. При этом важно иметь в виду, что мутагенное действие ФП не приводило к полному подавлению размножения вируса. Так, при концентрации ФП в среде 500 мкМ, которая рассматривается как эффективная терапевтическая [3, 26–30], урожай инфекционных вирусных частиц снижался лишь в 100–1000 раз до уровня около 10 3 инфекционных частиц в 1 мл питательной среды [23][31].

На рис. 2 схематически проиллюстрировано трехстороннее соотношение: (1) нарастание мутаций (транзиций) в геноме вируса по мере (2) снижения количеств вновь синтезируемого инфекционного вируса в популяции, формирующейся (3) при увеличении концентрации ФП в инкубационной среде заражённых клеточных культур. Наиболее опасной в плане появления вирусных мутантов служит зона средних концентраций ФП (отмечена штриховкой на рис. 2), когда при наличии относительно высокого уровня мутаций вирус еще сохранял инфекционность и способность к размножению. Вполне очевидно, что сохранившийся остаточный пул мутированных и инфекционных вирионов формировал основу для отбора мутантных вариантов вируса с непредсказуемыми и опасными свойствами, включая приобретение резистентности к химиопрепарату, расширение органного пантропизма и усиления его патогенности для людей.

Мишени противовирусного действия фавипиравира

Противовирусное действие ФП складывается из трех главных механизмов, которые обусловлены его структурными свойствами аналога пиримидинового нуклеозида. Благодаря такому сходству молекулы рибозилированного ФП функционально конкурируют с гуанозином и аденозином и их РТФ в биосинтетических путях (каскадах) в инфицированных клетках, происходящих с участием вирусной RdRp. В результате такой интерференции ФП нарушает процесс синтеза полноценных молекул вирусных РНК, что приводит к подавлению репродукции вируса [8][16][21][22]. Известны три главные мишени противовирусного действия ФП.

1. Прямое ингибирование вирусных полимераз

Это действие ФП обусловлено прямым узнаванием и связыванием нуклеозидной формы ФП-РТФ вирусными РНК-полимеразами, включая полимеразу коронавирусов, и блокированием её полимеразной функции. В результате замедляется и снижается синтез вирусных молекул в инфицированных клетках [4]. Эти исследования наиболее широко проведены на вирусах гриппа. Но поскольку механизмы каталитического действия вирусных РНК-полимераз имеют значительное структурное и функциональное сходство, есть все основания полагать, что они имеют общие параметры и характерны для полимераз большинства семейств РНК-содержащих вирусов, включая вирусы гриппа, коронавирусы, пикорна-, арена-, рабдо-, парамиксо-, флави-, гепадно-, норовирусы и др. [10][23][32]. Следует отметить, что среди РНК-содержащих вирусов РНК-полимераза COVID-19 по скорости присоединения нуклеотидов в 10 раз превосходит РНК-полимеразы вирусов гриппа, ящура и Эбола [23]. Такая быстрота коронавирусной полимеразы, необходимая коронавирусам для транскрипции гигантского генома около 30 × 10 3 нуклеотидов, делает РНК полимеразу (белок nsp12) наименее точной и допускающей в несколько раз больше ошибок (мутаций), чем РНК-полимеразу других вирусов. Мутагенное действие ФП усугубляет эту особенность полимеразы коронавируса COVID-19 и дополнительно повышает уровень мутаций в 3–12 раз, что способствует эффективности его летального мутагенеза на коронавирусы.

Вместе с тем коронавирусы, в отличие от других РНК-вирусов, имеют белок nsp14, который обладает функцией уточнения матричного считывания для исправления части сделанных ошибок и компенсации действия ФП [33]. Важная особенность ФП состоит в том, что его эффектор ФП-РТФ обладает высокой избирательностью на вирусный синтез и практически не влияет на клеточный метаболизм, поскольку такого класса ферментов, как RdRp, нет в клетках млекопитающих. Так, сравнение RdRp вируса гриппа с ДНК-зависимой РНК-полимеразой клеток млекопитающих показало, что 50% ингибирующая концентрация активного вещества для ФП в отношении указанных РНК-полимераз составляла 0,3 мкМ и более 950 мкМ соответственно [3].

2. Преждевременная терминация синтеза вирусных РНК

ФП, имея лишь частичное сходство с пуриновым основанием гуанина и в некоторой степени аденина, не может обеспечить полноценную комплементарность его спаривания с цитозином и урацилом при синтезе дочерних молекул РНК [11]. Отсутствие полной комплементарности затрудняет работу полимеразы и вызывает ее остановку на матрице РНК, что приводит к преждевременному обрыву синтеза РНК и формированию коротких молекул РНК [18][19]. Важно отметить, что доля гуанина в геноме SARS-CoV-2 невысока (около 17,5%), поэтому терминирующее действие ФП, направленное на это основание, может дополнительно усиливать летальный эффект на данный вирус [23]. Феномен образования преждевременно терминированных дефектных вирусных РНК, интерферирующих с полноценными вирусными молекулами РНК, приводит к ингибированию размножения вируса [8][16][21][22].

3. Встраивание ФП-РТФ в молекулы РНК и образование мутантных форм вируса

ФП-РТФ способен встраиваться в синтезирующиеся молекулы вирусных РНК и вызывать мутации в геномной или субгеномной РНК, которая входит в состав синтезируемых вирионов. В результате этого механизма формируется вирусная популяция дефектных неинфекционных вирионов, которые составляют подавляющую часть вирусной популяции при высоких концентрациях ФП (250 мкМ и более) [8][16][20][21][22]. Такие мутантные вирионы не способны поддерживать полноценное многоцикловое размножение вируса, но могут инициировать так называемую абортивную инфекцию клеток-мишеней без образования полноценного инфекционного вируса. Данный механизм получил название мутагенного действия химиопрепарата на вирусное потомство. Поскольку ФП-РТФ является аналогом (конкурентом) гуанозина и частично аденозина (A/G), его мутагенное действие в инфицированных вирусом клетках приводит к заменам (так называемым транзициям) в вирусном геноме главным образом двух типов: G→A и C→U [31]. Это структурно-функциональное свойство ФП лежит в основе его мутагенного действия.

Особенности и последствия мутагенного действия фавипиравира

В результате мутагенного действия ФП его применение приводит к значительному повышению частоты мутаций в геноме синтезируемых вирионов. Прирост таких мутаций имеет дозозависимый характер: при более высоких концентрациях препарата (> 100 мкМ) частота составляет 10 –1 –10 –2 мутаций на 1 нуклеотид в геноме, тогда как при пониженных концентрациях эта величина находится на уровне 10 –3 (рис. 2) [16][26][31]. Такой эффект мутагена порождает два важных последствия. При высоких концентрациях ФП количество мутаций чрезмерное, что несовместимо с жизнеспособностью образующегося вирусного потомства, — так называемое летальное действие. При низких концентрациях количество мутаций заметно снижается, но остается достаточным для обеспечения заметного повышения генетического разнообразия вирусного потомства на фоне сохранения его жизнеспособности [23][31].

Стимулирование мутагенеза вирусного генома приводит к ускорению микроэволюции вируса. Во-первых, при усиленном мутагенезе возрастает частота возникновения мутантных форм вируса, устойчивых к самому мутагенному препарату, так называемых ускользающих вирусных мутантов [8][11][22]. Во-вторых, за счет возникающих мутантных форм вируса возрастает общее генетическое разнообразие вирусной популяции, что заметно увеличивает вероятность появления опасных вирусных вариантов, обладающих повышенной контагиозностью и патогенностью для человека и расширенным кругом хозяев, создающим предпосылки перехода таких мутантных вариантов на домашних и сельскохозяйственных животных и формирования новых связей в круге хозяев вируса между человеком и животными. В результате могут возникать новые миграционные потоки вируса между различными видами животных, а также человеком.

Усиление процесса появления мутантных форм вируса в результате широкого лечебного применения мутагенного препарата(ов) может спровоцировать опасную эпидемическую проблему. Эта проблема возникновения опасных вирусных мутантов представляется особенно реальной в случае бессистемного применения химиопрепаратов мутагенного типа, особенно в случае свободного доступа к лекарству при отсутствии эффективного врачебного контроля его применения и мониторинга используемых терапевтических доз.

Пути снижения рисков появления опасных вирусных мутантов при применении химиопрепаратов мутагенного типа действия

При применении химиопрепаратов, обладающих мутагенным действием на вирус, для повышения мутагенного порога, затрудняющего возникновение генетического разнообразия инфекционного вируса и появление опасных вирусных мутантов, логично предложить три основных и практически реализуемых пути.

Первый путь для минимизации угрожающего мутагенного эффекта на вирус состоит в усовершенствовании структуры химиопрепарата. Модификация структуры мутагенного химиопрепарата, в частности ФП, должна заключаться в том, чтобы устранить его способность встраиваться в синтезируемую цепочку РНК и тем самым вызвать терминацию её элонгации и обрыв последующего синтеза полноценной молекулы. Достижение такой цели возможно, с одной стороны, путём заметного усиления аффинности нуклеозидной части препарата к полимеразе, чтобы сделать необратимым их комплексирование. С другой стороны — путём изменения структуры рибозил-трифосфатной группы, чтобы заблокировать и сделать невозможным образование фосфодиэфирной связи между химиопрепаратом и последующим нуклеотидным основанием, что остановит элонгацию и вызовет обрыв синтезируемой молекулы РНК.

Второй путь, затрудняющий появление опасных мутантов вируса, состоит в использовании комбинаций химиопрепаратов с различным механизмом действия, направленных на различные вирусные и/или клеточные мишени. Имеются многочисленные данные для многих химиопрепаратов, действующих на различные вирусные белки (ферменты), включая вирусную полимеразу, о том, что пассирование вирусов в присутствии одного химиопрепарата (так называемая монотерапия) приводит к быстрому формированию вирусных мутантов, устойчивых к данному химиопрепарату [8][11][22]. Как правило, устойчивый штамм имел мутацию в вирусном гене белка, против которого был направлен химиопрепарат. Однако в случае совместного (параллельного) применения 2 и более химиопрепаратов, действующих на различные вирусные и/или клеточные мишени, не удается наблюдать формирования мутантных штаммов даже после длительного пассирования вируса в присутствии комбинации химиопрепаратов [34–37]. На основании этих данных представляется рациональным и оправданным применение противовирусных химиопрепаратов, включая ФП, в комбинациях, в которых химиопрепараты имеют различные мишени противовирусного действия. Более того, такое комбинированное применение противовирусных лекарств имеет, как правило, значительно более высокую терапевтическую эффективность и синергидный противовирусный эффект [38–42].

Третий путь, позволяющий предотвратить опасные последствия мутагенного эффекта ФП, заключается в соблюдении диапазона оптимальных высоких доз препарата в организме реципиента. Таким ориентиром диапазона можно считать уровень перманентной концентрации в организме не менее 75 мкМ (

30 мг/кг массы) [23][26]. Оценка мутагенных концентраций ФП в культуре инфицированных вирусом гриппа клеток показывает, что концентрация 125 мкМ и выше обеспечивает эффективную терминацию синтеза вирусных РНК и их летальный мутагенез, что заметно тормозит образование жизнеспособных вирионов [8][16][21][22][26][43]. Экстраполяция этой концентрации с учетом биодоступности в организме человека даёт поддерживающую терапевтическую дозу химиопрепарата 20–50 мг/кг массы пациента в сутки и выше [44]. При снижении лечебных концентраций ФП в организме инфицированного пациента будут синтезироваться значительные количества угрожающих мутантных форм вируса разной степени инфекционности и с непредсказуемыми свойствами.

Заключение

Усиление синтеза мутантных форм вирионов под действием ФП несет угрозу появления новых опасных вирусных штаммов с повышенной патогенностью для человека и животных и приобретенной устойчивостью к химиопрепарату. Для минимизации мутагенного эффекта ФП возможны синтез новых модификаций ФП, лишённых способности встраиваться в молекулу синтезированной РНК; комбинированное применение ФП с противовирусными химиопрепаратами иного механизма и направленными на различные вирусные и/или клеточные мишени; непрерывное применение при строгом врачебном контроле высоких терапевтических доз ФП для усиления летального мутагенного эффекта на инфекционный вирус в организме-реципиенте для предотвращения размножения его мутантных форм.

Список литературы

1. Zhirnov O.P. Molecular targets in the chemotherapy of coronavirus infection. Biochemistry (Mosc). 2020; 85(5): 523–30. https://doi.org/10.1134/S0006297920050016

2. Tsai S.C., Lu C.C., Bau D.T., Chiu Y.J., Yen Y.T., Hsu Y.M., et al. Approaches towards fighting the COVID 19 pandemic (Review). Int. J. Mol. Med. 2020; 47(1): 3–22. https://doi.org/10.3892/ijmm.2020.4794

3. Furuta Y., Gowen B.B., Takahashi K., Shiraki K., Smee D.F., Barnard D.L. Favipiravir (T-705), a novel viral RNA polymerase inhibitor. Antiviral Res. 2013; 100(2): 446–54. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.09.015

4. Furuta Y., Komeno T., Nakamura T. Favipiravir (T-705), a broad spectrum inhibitor of viral RNA polymerase. Proc. Jpn Acad. Ser. B Phys. Biol. Sci. 2017; 93(7): 449–63. https://doi.org/10.2183/pjab.93.027

5. Furuta Y., Egawa H. Nitrogenous heterocyclic carboxamide derivatives or salts thereof and antiviral agents containing both. European Patent Office WO, 00/10569 (JP25044198 application 20.08.1998). WO2000010569A1; 2000.

6. Shiraki K., Daikoku T. Favipiravir, an anti-influenza drug against life-threatening RNA virus infections. Pharmacol Ther. 2020; 209: 107512. https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2020.107512

7. Pilkington V., Pepperrell T., Hill A. A review of the safety of favipiravir – a potential treatment in the COVID-19 pandemic? J. Virus Erad. 2020; 6(2): 45–51. https://doi.org/10.1016/s2055-6640(20)30016-9

8. Abdelnabi R., Morais A.T.S., Leyssen P., Imbert I., Beaucourt S., Blanc H., et al. Understanding the Mechanism of the Broad-Spectrum Antiviral Activity of Favipiravir (T-705): Key Role of the F1 Motif of the Viral Polymerase. J. Virol. 2017; 91(12): e00487–17. https://doi.org/10.1128/jvi.00487-17

9. Jordan P.C., Stevens S.K., Deval J. Nucleosides for the treatment of respiratory RNA virus infections. Antivir. Chem. Chemother. 2018; 26: 2040206618764483. https://doi.org/10.1177/2040206618764483

10. Neogi U., Hill K.J., Ambikan A.T., Heng X., Quinn T.P., Byrareddy S.N., et al. Feasibility of Known RNA Polymerase Inhibitors as Anti-SARS-CoV-2 Drugs. Pathogens. 2020; 9(5): 320. https://doi.org/10.3390/pathogens9050320

11. Delang L., Abdelnabi R., Neyts J. Favipiravir as a potential countermeasure against neglected and emerging RNA viruses. Antiviral Res. 2018; 153: 85–94. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2018.03.003

12. Sada M., Saraya T., Ishii H., Okayama K., Hayashi Y., Tsugawa T., et al. Detailed molecular interactions of Favipiravir with SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, and influenza virus polymerases in silico. Microorganisms. 2020; 8(10): 1610. https://doi.org/10.3390/microorganisms8101610

13. Naesens L., Guddat L.W., Keough D.T., van Kuilenburg A.B., Meijer J., Vande Voorde J., et al. Role of human hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase in activation of the antiviral agent T-705 (favipiravir). Mol. Pharmacol. 2013; 84(4): 615–29. https://doi.org/10.1124/mol.113.087247

14. Smee D.F., Hurst B.L., Egawa H., Takahashi K., Kadota T., Furuta Y. Intracellular metabolism of favipiravir (T-705) in uninfected and influenza A (H5N1) virus-infected cells. J. Antimicrob. Chemother. 2009; 64(4): 741–6. https://doi.org/10.1093/jac/dkp274

15. Bixler S.L., Bocan T.M., Wells J., Wetzel K.S., Van Tongeren S.A., Garza N.L., et al. Intracellular conversion and in vivo dose response of favipiravir (T-705) in rodents infected with Ebola virus. Antiviral Res. 2018; 151: 50–4. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2017.12.020

16. Baranovich T., Wong S.S., Armstrong J., Marjuki H., Webby R.J., Webster R.G., et al. T-705 (favipiravir) induces lethal mutagenesis in influenza A H1N1 viruses in vitro. J. Virol. 2013; 87(7): 3741–51. https://doi.org/10.1128/jvi.02346-12

17. Arias A., Thorne L., Goodfellow I. Favipiravir elicit antiviral mutagenesis during virus replication in vivo. eLife. 2014; 3: e03679. https://doi.org/10.7554/elife.03679

18. Sangawa H., Komeno T., Nishikawa H., Yoshida A., Takahashi K., Nomura N., et al. Mechanism of action of T-705 ribosyl triphosphate against influenza virus RNA polymerase. Antimicrob. Agents Chemother. 2013; 57(11): 5202–8. https://doi.org/10.1128/aac.00649-13

19. Jin Z., Smith L.K., Rajwanshi V.K., Kim B., Deval J. The ambiguous base-pairing and high substrate efficiency of T-705 (Favipiravir) ribofuranosyl 5’-triphosphate towards influenza A virus polymerase. PLoS One. 2013; 8(7): e68347. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0068347

20. de Ávila A.I., Gallego I., Soria M.E., Gregori J., Quer J., Esteban J.I., et al. Lethal mutagenesis of hepatitis C virus induced by Favipiravir. PLoS One. 2016; 11(10): e0164691. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0164691

21. Guedj J., Piorkowski G., Jacquot F., Madelain V., Nguyen T.H.T., Rodallec A., et al. Antiviral efficacy of Favipiravir against Ebola virus: A translational study in cynomolgus macaques. PLoS Med. 2018; 15(3): e1002535. https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1002535

22. Goldhill D.H., te Velthuis A.J.W., Fletcher R.A., Langat P., Zambon M., Lackenby A., et al. The mechanism of resistance to Favipiravir in influenza. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2018; 115(45): 11613–8. https://doi.org/10.1073/pnas.1811345115

23. Shannon A., Selisko B., Le N.T., Huchting J., Touret F., Piorkowski G., et al. Rapid incorporation of Favipiravir by the fast and permissive viral RNA polymerase complex results in SARS-CoV-2 lethal mutagenesis. Nat. Commun. 2020; 11(1): 4682. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18463-z

24. Grande-Pérez A., Lazaro E., Lowenstein P., Domingo E., Manrubia S.C. Suppression of viral infectivity through lethal defection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(12): 4448–52. https://doi.org/10.1073/pnas.0408871102

25. Perales C., Mateo R., Mateu M.G., Domingo E. Insights into RNA virus mutant spectrum and lethal mutagenesis events: replicative interference and complementation by multiple point mutants. J. Mol. Biol. 2007; 369(4): 985–1000. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.03.074

26. Wang M., Cao R., Zhang L., Yang X., Liu J., Xu M., et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell. Res. 2020; 30: 269–71. https://doi.org/10.1038/s41422-020-0282-0

27. Cai Q., Yang M., Liu D., Chen J., Shu D., Xia J., et al. Experimental treatment with Favipiravir for COVID-19: An open-label control study. Engineering (Beijing). 2020; 6(10): 1192–8. https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.03.007

28. Joshi S., Parkar J., Ansari A., Vora A., Talwar D., Tiwaskar M., et al. Role of Favipiravir in the treatment of COVID-19. Int. J. Infect. Dis. 2020; 102: 501–8. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.10.069

29. Ivashchenko A.A., Dmitriev K.A., Vostokova N.V., Azarova V.N., Blinow A.A., Egorova A.N., et al. AVIFAVIR for treatment of patients with moderate COVID-19: Interim results of a phase II/III multicenter randomized clinical trial. Clin. Infect. Dis. 2020; ciaa1176. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa1176

30. Eloy P., Solas C., Touret F., Mentré F., Malvy D., de Lamballerie X., et al. Dose rationale for Favipiravir use in patients infected with SARS-CoV-2. Clin. Pharmacol. Ther. 2020; 108(2): 188. https://doi.org/10.1002/cpt.1877

31. Perales C., Gallego I., de ́Avila A.I., Soria M.E., Gregori J., Quer J., et al. The increasing impact of lethal mutagenesis of viruses. Future Med. Chem. 2019; 11(13): 1645–57. https://doi.org/10.4155/fmc-2018-0457

32. Li G., De Clercq E. Therapeutic options for the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV). Nat. Rev. Drug Discov. 2020; 19(3): 149–50. https://doi.org/10.1038/d41573-020-00016-0

33. Ferron F. Structural and molecular basis of mismatch correction and ribavirin excision from coronavirus RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018; 115(2): E162–71. https://doi.org/10.1073/pnas.1718806115

34. Ilyushina N.A., Bovin N.V., Webster R.G., Govorkova E.A. Combination chemotherapy, a potential strategy for reducing the emergence of drug-resistant influenza A variants. Antiviral Res. 2006; 70(3): 121–31. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2006.01.012

35. Lu Y., Hardes K., Dahms S.O., Böttcher-Friebertshäuser E., Steinmetzer T., Than M.E., et al. Peptidomimetic furin inhibitor MI-701 in combination with oseltamivir and ribavirin efficiently blocks propagation of highly pathogenic avian influenza viruses and delays high level oseltamivir resistance in MDCK cells. Antiviral Res. 2015; 120: 89–100. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2015.05.006

36. Baz M., Carbonneau J., Rhéaume C., Cavanagh M.H., Boivin G. Combination therapy with Oseltamivir and Favipiravir delays mortality but does not prevent Oseltamivir resistance in immunodeficient mice infected with pandemic A(H1N1) influenza virus. Viruses. 2018; 10(11): 610. https://doi.org/10.3390/v10110610

37. Beigel J.H., Bao Y., Beeler J., Manosuthi W., Slandzicki A., Dar S.M., et al. A randomized double-blind phase 2 study of combination antivirals for the treatment of influenza. Lancet Infect. Dis. 2017; 17: 1255–65. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30476-0

38. Hurt A.C., Ison M.G., Hayden F.G., Hay A.J. Second isirv antiviral group conference: overview. Influenza Other Respir. Viruses. 2013; 7(Suppl. 3): 1–7. https://doi.org/10.1111/irv.12207

39. Dunning J., Baillie J.K., Cao B., Hayden F.G. Antiviral combinations for severe influenza. Lancet Infect. Dis. 2014; 14(12): 1259–70. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(14)70821-7

40. Li X., Yang Y., Liu L., Yang X., Zhao X., Li Y., et al. Effect of combination antiviral therapy on hematological profiles in 151 adults hospitalized with severe coronavirus disease 2019. Pharmacol. Res. 2020; 160: 105036. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2020.105036

41. Ortega J.T., Zambrano J.L., Jastrzebska B., Liprandi F., Rangel H.R., Pujol F.H. Understanding severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 replication to design efficient drug combination therapies. Intervirology. 2020; 63(1-6): 2–9. https://doi.org/10.1159/000512141

42. Zhirnov O.P. High protection of animals lethally infected with influenza virus by aprotinin-rimantadine combination. J. Med. Virol. 1987; 21(2): 161–7. https://doi.org/10.1002/jmv.1890210208

43. Furuta Y., Takahashi K., Kuno-Maekawa M., Sangawa H., Uehara S., Kozaki K., et al. Mechanism of action of T-705 against influenza virus. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49(3): 981–6. https://doi.org/10.1128/AAC.49.3.981-986.2005

44. Du Y.X., Chen X.P. Response to “Dose rationale for Favipiravir use in patients infected with SARS-CoV-2”. Clin. Pharmacol. Ther. 2020; 108(2): 190. https://doi.org/10.1002/cpt.1878

Об авторах

Жирнов Олег Петрович — доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, рукководитель лабораторией вирусного патогенеза Института вирусологии им. Д.И. Ивановского НЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; рукководитель лабораторией вирусного патогенеза Русско-немецкой академии медико-социальных и биотехнологических наук

Чернышова Алёна Игоревна — младший научный сотрудник лаборотории иммунологии Института вирусологии им. Д.И. Ивановского НЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; научный сотрудник Русско-немецкой академии медико-социальных и биотехнологических наук

Источник