За что отвечают фибробласты

Факты о фибробластах

Тело человека состоит из триллионов разнообразных клеток. Наиболее важными клетками самого большого органа в теле человека – кожи, являются фибробласты. Их называют клетками молодости, так как именно активная работа фибробластов способствует поддержанию молодости и красоты кожи.

Фибробласты

Зародышевые клетки соединительной ткани организма. Они участвуют в процессах регенерации и синтеза белков, наиболее важных для омоложения клеток дермы.

В организме человека фибробласты могут находиться в двух формах: активные и неактивные. Активный фибробласт имеет большой размер, отростки, овальное ядро и много рибосом. Такая клетка может делиться и интенсивно вырабатывать коллаген. Неактивные фибробласты называются также фиброцитами. Они являются высокодифференцированными клетками, которые образовываются их фибробластов, не имеют способности к делению, но принимают активное участие в синтезе волокнистых структур и заживлении ран. Неактивные фибробласты имеют несколько меньший размер, чем активные, и отличаются веретенообразной формой.

Все активные фибробласты разделяются на несколько структурно-функциональных типов, каждый из которых выполняет определенные функции:

— малодифференцированные фибробласты обладают выраженными пролиферативными свойствами, то есть, они активно размножаются и растут;

— юные фибробласты – более дифференцированные клетки, которые также способны к пролиферации, но в отличие от малодифференцированных, могут синтезировать коллаген и кислые гликозаминогликаны;

— зрелые фибробласты образуются из юных форм, практически не могут размножаться, и разделяются на три подтипа:

Фибробласты располагаются в среднем слое кожи человека – в дерме. Там они вырабатывают внеклеточный матрикс, компоненты которого и формируют своеобразный каркас кожи. Основными компонентами внеклеточного матрикса являются гликопротеины, протеогликаны и гиалуроновая кислота. Широко известный коллаген является превалирующим гликопротеином внеклеточного матрикса. Кроме того, фибробласты продуцируют также белки фибрин, эластин, тинасцин, нидоген и ламинин, которые используются в качестве «строительного материала» для кожи.

Еще один продукт синтеза фибробластов – это факторы клеточного роста, к которым относятся:

Основные функции фибробластов:

С возрастом в организме человека способности фибробластов в плане активного синтеза и пролиферации в тканях кожи снижаются, в результате чего происходит уменьшение содержания их главных компонентов — гиалуроновой кислоты, коллагена, эластина, сосудистой сети. Это отражается на внешнем виде кожного покрова.

Сегодня, благодаря успехам биотехнологии, появилась возможность естественным путем повлиять непосредственно на причину возрастного увядания кожных тканей. Этого удалось достигнуть способом обогащения ее собственными молодыми фибробластами, которые являются строителями внеклеточного матрикса.

Трансплантация в кожу лица собственных молодых клеток фибробластов способна эффективно и достаточно быстро активизировать процессы обновления и восстановления ее структуры. Аутологичные (свои) клетки не воспринимаются собственной иммунной системой как антиген (чужеродные) и, следовательно, организмом не отторгаются, а полноценно функционируют. Преимуществом клеточного омоложения является и то, что трансплантированные фибробласты долгое время (от полугода до полутора лет) сохраняют функциональную активность в части усиленного синтеза гиалуроновой кислоты, коллагена, эластина и других компонентов матриксной системы кожи. В течение этого срока постоянно продолжается улучшение ее состояния.

Такая методика аутотрансплантации фибробластов в косметологии получила официальное разрешение Росздравнадзора.

Источник

За что отвечают фибробласты

В этой статье поговорим о функции дермальных фибробластов в коже, процессе их старения, а также о методе обновления и стимуляции регенерации кожи путём введения аутологичных фибробластов.

Введение

Роль дермальных фибробластов (ДФ) в обновлении кожи трудно переоценить, поскольку они являются основным клеточным компонентом соединительнотканной основы кожи, обеспечивающим её гомеостаз и морфофункциональную организацию. Очевидна актуальность этой темы для регенеративной (репаративной) косметологии, задача которой — омоложение кожи путём активации естественных процессов её восстановления.

Функции дермальных фибробластов

Из всех функций ДФ наибольшее внимание специалистов в области эстетической медицины и дерматологии сосредоточено на продуцировании этими клетками компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) дермы: коллагена, эластина, протеогликанов, особенно гиалуроновой кислоты (ГК), и структурных гликопротеинов.

Повышенный интерес именно к этой функции ДФ понятен: названные компоненты ВКМ формируют и поддерживают структуру кожи, обеспечивая её упругость и прочность. Причём ДФ не только синтезируют эти вещества, но и обеспечивают их катаболизм путём прямого фагоцитоза «отработанных» фрагментов фибрилл коллагена и эластина, секреции коллагеназы, гиалуронидазы и прочих ферментов.

Резидентные клетки ткани — образующиеся и постоянно пребывающие в этой ткани.

Другая, и не менее значимая для кожи, активность ДФ оставалась до недавнего времени несколько на обочине поля зрения врачей-практиков, однако сегодня она тоже становится объектом пристального внимания клиницистов. Речь идёт о целом ряде важнейших функций фибробластов. Так, продуцируя коллаген IV типа и ламинин, они влияют на формирование базальной мембраны. Фибробласты формируют строму, которая не только служит каркасом (опорой) для эпителия, но и регулирует структурную организацию и функционирование эпителиальных клеток. Они вырабатывают и выделяют факторы клеточного роста (KGF-1 — фактор роста кератиноцитов, GM–CSF — гранулоцитарно-макрафагальный колониестимулирующий фактор роста), иммунорегуляторные интерлейкины IL-6, IL-8. За счёт секреции факторов роста и интерлейкинов и непосредственного взаимодействия с эпителиальными клетками ДФ играют ключевую роль в регуляции эпидермального морфогенеза. Их паракринная активность служит основой для поддержания гомеостаза стволовых кератиноцитов.

Дермальные фибробласты секретируют факторы, влияющие на дифференцировку лимфоцитов, и факторы, регулирующие численность, миграцию и функции гранулоцитов и макрофагов, обеспечивая тем самым поддержание иммунитета кожи. Вырабатывая множество проангиогенных факторов, которые индуцируют дифференцировку и миграцию эндотелиальных клеток, ДФ способствуют образованию и стабилизации сосудов.

Они принимают участие в процессах нейроэндокринной регуляции кожи. Синтезируют биологически активные пептиды: гормоны, биогенные амины, нейропептиды и нейротрансмиттеры, идентичные таковым в центральной нервной и эндокринной системах, экспрессируют рецепторы андрогенов и эстрогенов, посредством которых осуществляется влияние этих гормонов на кожу человека.

Фибробласты, взаимодействуя с различными резидентными клетками: эпидермальными, эндотелиальными, нервными, жировыми, гемопоэтическими, участвуют практически во всех кожных процессах, в том числе — физиопатологических. Таким образом, ДФ представляют собой центральное звено в биологии кожи: они поддерживают не только гомеостаз ВКМ дермы, обеспечивая её ремоделирование и обновление, но и физиологическое состояние других слоёв и структур кожи.

Рис. 1. Взаиморасположение фибробластов и коллагеновых волокон: a — в коже молодых людей (18–29 лет); b — в коже людей старшего возраста (старше 80 лет) (Varani J., et al. 2006, с изм.)

Инволюция дермальных фибробластов

По мере старения организма растёт число ДФ, в которых происходят возрастзависимые изменения, связанные преимущественно с непрерывным накоплением повреждений. Такие ДФ обозначают как «стареющие», или сенесцентные фибробласты (ДФст). Снижается их способность к ремоделированию и организации ВКМ, так как уменьшается синтез и секреция ими основных компонентов ВКМ. Нарушается эпидермальный гомеостаз из‑за негативных изменений в паракринных механизмах, связывающих эпидермис и папиллярный слой дермы. В популяции ДФст происходит увеличение секреции богатого цистеином ангиогенного индуктора — белка 61 (CYR61, или CCN1), стимулирующего продукцию провоспалительных цитокинов и матриксных металлопротеиназ (MMPs). CCN1 и MMPs поддерживают старение клетки путём негативной регуляции гомеостаза коллагена и увеличения его деградации.

Постепенно баланс между синтезом и деградацией коллагена нарушается в пользу последней. Повреждённый коллагеновый каркас ВКМ уже не может удерживать фибробласты в растянутом состоянии, свойственном молодым клеткам. Происходит своего рода коллапс фибробластов, что приводит к нарушению их функций. В процессе инволюции уменьшается численность фибробластов. Снижается и биосинтетическая активность этих клеток, нарушается баланс между синтезом и деградацией ВКМ дермы. В среднем, у пожилых / старых людей, по сравнению с молодыми, общее количество ДФ меньше на 35 %, продукция коллагена в коже снижена на 75 %, причём содержание коллагена уменьшается приблизительно на 1 % в год.

Все сенесцентные изменения в популяции ДФ приводят к постепенному и значительному снижению способности кожи к регенерации и обновлению. Как при этом меняется статус кожи? Уменьшается её толщина, снижается упругость и эластичность, появляются морщины, заломы, птоз тканей — кожа стареет.

Очевидно, что именно ДФ должны быть основной «мишенью» омолаживающих кожу косметологических методов. Так оно и есть: все современные терапевтические воздействия в целях коррекции возрастных изменений кожи — инъекционные, включая PRP-терапию, аппаратные (лазерные, радиочастотные, ультразвуковые) — направлены прежде всего на стимуляцию функциональной активности ДФ, как пролиферативной, так и биосинтетической. Особое место в этом ряду занимает применение аутологичных (собственных) дермальных фибробластов, или SPRS-терапия.

SPRS-терапия как метод оздоровления и обновления кожи

SPRS-терапия (SPRS — от англ. Service for Personal Regeneration of Skin — персонифицированный комплекс лечебно-диагностических процедур для восстановления кожи) — метод регенеративной медицины (РУ ФС №2009 / 308 от 21.07.2010). Его применение позволяет восполнить уменьшившуюся с возрастом популяцию ДФ за счёт введенных в кожу специализированных молодых и функционально активных клеток. Трансплантируются собственные фибробласты кожи пациента, поэтому они полноценно приживаются, интегрируют с резидентной клеточной популяцией и живут «по законам» дермы.

После трансплантации их биосинтетическая активность сохраняется не менее года, причём без какой‑либо дополнительной стимуляции. Как результат, увеличивается синтез коллагена и других компонентов ВКМ, благодаря чему происходит ремоделирование микроструктуры дермы, увеличение её толщины, уменьшение количества и глубины морщин.

Сенесценция — это состояние, при котором клетки с накопленными повреждениями ДНК и истощением механизмов её восстановления перестают делиться, теряют способность к ремоделированию и организации ВКМ.

Описание технологии

В специализированной лаборатории Института стволовых клеток человека, соответствующей международным стандартам GMP*, из 4 мм биоптата кожи пациента получают клеточный препарат, содержащий культивированные аутологичные ДФ (аутоДФ). На этапах клеточного процессинга происходит отбор и стимуляция только функционально активных ДФ, которые, несмотря на старение организма, сохраняют высокую способность к делению и синтезу важных для кожи компонентов. Дело в том, что пролиферативный потенциал всей популяции дермальных фибробластов взрослого человека в течение всей его жизни остаётся на довольно высоком уровне — благодаря наличию в фибробластическом диффероне стволовых / прогениторных клеток. Это клетки-предшественницы, которые отвечают за обновление клеточной популяции дермы. Как показали исследования in vitro, первичные культуры, полученные даже от очень пожилых людей (95 лет), содержат до 14 % митотически активных фибробластов.

Рис. 3. Относительное изменение толщины кожи после применения аутоДФ (по результатам гистологических исследований).

Данный факт подтверждается и нашими экспериментами: культуры фибробластов дермы, полученные от пациентов 18–82 лет, характеризуются довольно высокой эффективностью колониеобразования (45.0±9.5 %), независимо от возраста донора. Это даёт возможность из небольшого биоптата кожи любого взрослого человека получить необходимое для проведения терапии количество функционально активных клеток.

После трансплантации культивированных ауто ДФ в дерму их биосинтетическая активность сохраняется. В своей работе мы вводили полученный клеточный материал одновременно и в кожу лица, и в кожу за ушной раковиной, откуда затем проводили забор биоптата для гистологического изучения. Наши исследования показали:

Через 24 месяца после применения аутоДФ в дерме также регистрировали отдельные группы фибробластоподобных клеток [Рис. 4], продуцирующих коллагеновые волокна. Однако признаков созревания (утолщения) коллагена не наблюдали, из чего следует, что через два года после трансплантации аутоДФ интенсивность их синтетической активности (по сравнению с таковой в течение первого года после трансплантации) была снижена.

Рис. 4. Кожа пациента М. (54 г.) после применения аутоДФ через 24 месяца. Левая колонка — окраска гематоксилином и эозином, правая колонка — импрегнация нитратом серебра. Ув. ×200. Препараты и микрофотографии Р. В. Деева.

Скорее всего, это связано с уровнем физиологических потребностей дермы (известно, что для обеспечения её физиологического состояния достаточно незначительной функциональной активности фибробластов). По всей видимости, трансплантированные аутоДФ полноценно интегрировались с дермой, стали естественной составляющей её основной клеточной популяции — фибробластического дифферона — и находятся под контролем микроокружения.

Выводы гистологического исследования:

Выявленная на гистологическом уровне положительная динамика изменений кожи после применения аутоДФ полностью соответствует клинической картине. Уже через 10–14 дней после окончания курса SPRS-терапии отмечается повышение упругости кожи, уменьшение её рельефности (уменьшение выраженности морщин), улучшение цвета и контуров лица. Эффект имеет нарастающий характер. Так, если через месяц после инъекции на «хорошо» и «отлично» клинический результат оценили 88 % пациентов, то уже через три месяца и позже — 100 %. Врачи-исследователи через месяц определили результат как «хороший» и «отличный» у 86 % пациентов, через три месяца и позже — у 100 % пациентов. Положительные, прогрессирующие со временем (на протяжении как минимум 12 месяцев) изменения состояния кожи подтверждены нами и с помощью инструментальных методов исследования.

Заключение

Инновационная технология — SPRS-терапия, основанная на принципах регенеративной медицины, — позволяет восстанавливать утраченные с возрастом структуру и функции дермы за счёт уникального биологического механизма собственных коллагенобразующих клеток кожи пациента.

SPRS-терапия используется в отечественной эстетической медицине более восьми лет, зафиксировано более 1000 клинических наблюдений пациентов, из которых более 80 % повторно (два и более раз), пролечив одну область кожи, обращались в клиники для лечения этим методом кожи других областей.

Для врачебной практики важно, что SPRS-терапия является не только самостоятельным эффективным методом ремоделирования дермы, но и хорошей базовой основой для применения других косметологических вмешательств, направленных на стимуляцию синтетической активности фибробластов, что позволяет в течение длительного времени поддерживать кожу пациента в хорошем состоянии.

Авторы:
Алла Зорина, к. м. н., врач-биохимик, Москва.
Вадим Зорин, к. б. н., врач-биофизик, Москва.

Источник

ПодробностиМесто расположенияСоединительная тканьФункцияВнеклеточный матрикс и создание коллагенаИдентификаторылатинскийфибробластMeSHD005347THH2.00.03.0.01002FMA63877Анатомические термины микроанатомии

СОДЕРЖАНИЕ

Состав

Продолжительность жизни фибробласта, измеренная на куриных эмбрионах, составляет 57 ± 3 дня.

Связь с фиброцитами

Фибробласты морфологически неоднородны и имеют разнообразный внешний вид в зависимости от их местоположения и активности. Хотя морфологически незаметные, эктопически трансплантированные фибробласты часто могут сохранять позиционную память о местоположении и тканевом контексте, где они ранее находились, по крайней мере, в течение нескольких поколений. Такое примечательное поведение может вызвать дискомфорт в том редком случае, когда они там чрезмерно застаиваются.

Разработка

Напротив, фибробласты в некоторых ситуациях могут давать начало эпителию, претерпевая переход от мезенхимы к эпителию (MET) и организуясь в конденсированный, поляризованный, латерально связанный истинный эпителиальный лист. Этот процесс наблюдается во многих ситуациях развития (например, развитие нефрона и нокорды ), а также при заживлении ран и онкогенезе.

Функция

Воспаление

Помимо их общеизвестной роли в качестве структурных компонентов, фибробласты играют решающую роль в иммунном ответе на повреждение ткани. Они являются первыми игроками в инициации воспаления в присутствии вторгшихся микроорганизмов. Они вызывают синтез хемокинов за счет представления рецепторов на своей поверхности. Затем иммунные клетки реагируют и инициируют каскад событий, чтобы избавиться от инвазивных микроорганизмов. Рецепторы на поверхности фибробластов также позволяют регулировать кроветворные клетки и обеспечивают путь иммунным клеткам для регулирования фибробластов.

Опухолевое посредничество

Иммунная регуляция опухолей также может происходить с помощью модуляторов, производных от TAF. Хотя эти модуляторы могут звучать аналогично компонентам ECM, полученным из TAF, они отличаются в том смысле, что они несут ответственность за изменение и оборот ECM. Расщепленные молекулы ЕСМ могут играть решающую роль в иммунной регуляции. Известно, что протеазы, подобные матриксным металлопротеинеазам (ММР) и системе uPA, расщепляют ЕСМ. Эти протеазы происходят из фибробластов.

Вторичные действия

В связи с клиническим применением тканей, полученных из стволовых клеток, было изучено использование человеческих фибробластов в качестве питателей. Хотя фибробласты обычно используются для поддержания плюрипотентности стволовых клеток, их также можно использовать для облегчения развития стволовых клеток в клетки определенного типа, такие как кардиомиоциты.

Иммунный ответ хозяина

Источник

Фибробласты и влияние на них препарата Meso–Wharton P199™: экспериментальные исследования

С. Г. Морозов, доктор мед. наук, член-корреспондент РАН, профессор, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования

Е. Н. Волкова, доктор мед. наук, профессор, врач-дерматовенеролог, директор Научно-образовательного департамента «Премьер Фарм»

И. Н. Сабурина, доктор биол. наук, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования

И. М. Зурина, младший науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии

Н. В. Кошелева, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Биологический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

А. А. Горкун, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии

К. В. Кожина, врач-косметолог, сертифицированный тренер «Премьер Фарм»

Введение

Старение – сложный биологический процесс, характеризующийся структурными, функциональными и обменными изменениями клеточных структур тканей. В отличие от внутренних органов, старение которых происходит достаточно скрытно, признаки этого процесса на коже всегда заметны.

Патоморфологически старение кожи характеризуется уменьшением ее толщины, снижением количества фибробластов, их размеров, скорости пролиферации, сглаживанием дермально-эпидермальной границы. Снижение синтетической активности клеток дермы приводит к уменьшению продукции ими таких важных компонентов основного вещества дермы, как коллагены, гликозаминогликаны, фибронектин и эластин (1, 2).

В настоящее время существует ряд препаратов для коррекции возрастных изменений кожи на клеточном уровне. К используемым препаратам предъявляются строгие требования: они должны быть безопасны, не аллергенны, эффективны, рентабельны, удобны в применении. Этим высоким требованиям отвечает инъекционный препарат Meso-Wharton P199™, предназначенный для интенсивной «репарации» кожи. Ключевой компонент препарата – Wharton Jelly Peptide P199 (P199) – синтетический аналог эмбрионального пептида, именно этот пептид инициирует глубокие, стойкие антивозрастные и регенерационные эффекты в коже.

Для подтверждения anti-age эффективности Meso-Wharton P199™ могут быть использованы разные объекты исследования – культуры клеток: кератиноциты, эндотелиальные клетки, меланоциты и дермальные фибробласты человека (3). Дермальные фибробласты представляют собой гетерогенную клеточную популяцию мезенхимного ряда и играют ключевую роль в регуляции процессов гомеостаза и восстановления кожного покрова. Они формируют оптимальные условия для пролиферации и функционирования других типов клеток (кератиноцитов, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), регулируя клеточные взаимодействия (4, 5). Фибробласты продуцируют проколлаген, фибронектин, проэластин, гликозаминогликаны и ламинин, участвуют в формировании базальной мембраны кожи, продуцируют и выделяют в межклеточное пространство цитокины и факторы роста (6, 7). Также фибробласты играют важную роль в процессах эпителизации и заживления ран (8, 9). Поэтому они являются основной мишенью воздействия активных веществ, направленных как на омоложение кожи, так и на ее репарацию (10, 11).

Известно, что при длительном культивировании фибробластов происходит репликативное старение культуры. Старение культуры фибробластов in vitro максимально близко отражает изменения, присущие старению кожи in vivo. Вместе с тем последние исследования показали, что при длительном культивировании в монослое клетки теряют не только способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, но и возникает риск накопления в клетках хромосомных аберраций (12). Кроме того, культивирование клеток в монослое не является естественным, изменяет характеристики клеток и не отражает реальные механизмы функционального состояния соматических клеток. При длительном культивировании в монослое клетки теряют одно из важнейших свойств своей функциональной активности – эпителио-мезенхимо-эпителиальную пластичность (13, 14, 15). 3D-культура (сфероиды) по своим свойствам более полно повторяет нативную ткань по плотности клеток на единицу объема и представляет собой динамичную систему с организованным клеточным поведением – необходимым условием полноценного морфогенеза.

Цель нашего исследования заключалась в комплексном, многоплановом изучении влияния препарата Meso–Wharton P199™ как на 2D-, так и в 3D-культурах дермальных фибробластов человека.

Материалы и методы

Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи посредством механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Для этого биоптат промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик (гентомицин) и обрабатывали раствором трипсина. Затем пипетировали, в результате чего освобождали клетки от матрикса, центрифугировали, отмывали от раствора трипсина и ресуспендировали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 10 % сыворотки. Высевали на чашки Петри в плотности 1 × 105 – 2 × 105 клеток/см2 и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 4-го пассажа, охарактеризовывали по экспрессии характерных маркеров и криоконсервировали, создавая банк первичной культуры дермальных фибробластов человека, на которой проводили все дальнейшие исследования. Использование в исследовании одной и той же первичной культуры клеток позволяет сопоставлять и сравнивать полученные данные.

Для получения «стареющей» культуры клетки из полученного ранее банка размораживали методом быстрого оттаивания при +37 0С, отмывали от остатков сыворотки и ДМСО раствором Хенкса с помощью центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 g. Супернатант удаляли, полученный осадок из клеток ресуспендировали в полной ростовой среде, высевали на чашки Петри и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 18-го пассажа, когда становились хорошо заметны все признаки репликативного старения дермальных фибробластов. Размороженная, не пассированная культура клеток 4-го пассажа (Р4) считалась контрольной и соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи.

Для исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре аликвоты (500 мкл) пептида P199, растворенного в солевом буфере, смешивали с полной ростовой средой в соотношении 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000. Анализ цитотоксичности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа (Р18). Клетки помещали на 12-луночные планшеты в плотности 10 000 клеток на лунку. В качестве контроля исследовали поведение клеток в полной ростовой среде без добавления пептида. Клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее окрашивали растворами Hoechst 33258 (0,004 мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001 мг/мл), с помощью которого оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI под инвертированным флуоресцентным микроскопом Olympus CKX41 (Olympus, Япония).

Анализ биоактивности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов и помещали на покровные стекла в чашки Петри (35 мм). Исследовали морфологию клеток и экспрессию характерных для фибробластов маркеров: цитокератина 19, эластина, α-гладкомышечного актина (αSMA), PCNA (маркера пролиферации), коллагенов I, III и IV типов. В качестве контроля культивировали клетки 18-го пассажа в полной ростовой среде без добавления препарата. Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее фиксировали в 4 % растворе параформальдегида (4 0С, 20 мин.). Затем стекла инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, α-гладкомышечному актину (αSMA), PCNA (маркеру пролиферации), коллагенам I, III и IV. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (E=525 nm) и DyLight594 (E=617 nm). Ядра докрашивали раствором Hoechst 33258 (0,004 мг/мл). Анализ проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 (Olympus, Япония).

Для изучения влияния препарата Meso-Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов исследовали монослойные клеточные культуры фибробластов Р18, которые культивировали с добавлением в ростовую среду препарата Meso–Wharton P199™ и культуры фибробластов Р18, культивируемые без добавления препарата Meso-Wharton P199™. Для данного этапа исследования использовали аликвоты (500 мкл) пептида р199, растворенного в солевом буфере, и смешаные с полной ростовой средой в соотношении 1:10. Фибробласты культивировали в течение 72 ч., отмывали от ростовой среды раствором Версена, затем обрабатывали 0,25 % раствором трипсина и снимали с чашек. Подсчитывали количество клеток в суспензии и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1 × 103 клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ (СМ Technologies, Финляндия) в течение семи дней. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 мин. с помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили в программном пакете Cell-IQ Analyzer. Положительным контролем считали формирование сфероидов из фибробластов 4-го пассажа (Р4) в полной ростовой среде без добавления пептида.

Результаты и обсуждение

В культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа, которые использовали для дальнейших исследований как стареющую, были хорошо заметны все признаки репликативного старения: спонтанное увеличение размера клеток, преобладание крупных плащевидных и парусовидных клеток (Рис. 1а). Темпы клеточного деления резко снижались. Контрольная культура (Р4) соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи. В ней преобладали небольшие веретеновидные клетки, которые хорошо пролифелировали (Рис. 1б).

Рис. 1. Культуры дермальных фибробластов, используемые для дальнейшего исследования.
а – опытная культура фибробластов (Р18) – соответствует зрелой (стареющей) кожи;
б – контрольная культура фибробластов (Р4) – соответствует молодой коже

По экспрессии характерных для фибробластов маркеров культура 18-го пассажа (Р18) также соответствовала возрастным изменениям, наблюдаемым в коже in vivo. Контрольные клетки активно экспрессировали характерные для фибробластов маркеры (цитокератина 19, эластина, коллагенов I, III и IV типов), отвечающие за основные биомеханические свойства кожи, такие как гладкость, упругость, эластичность (Рис. 2а, б, в), а в опытной культуре (Р18) экспрессия маркеров заметно снижалась по сравнению с контрольной культурой (Рис. 3а, б, в).

Рис. 2. Контрольная культура фибробластов (Р4)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа

Рис. 3. Опытная культура фибробластов (Р18)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа

Результаты исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре показали, что предлагаемые разведения 1:10, 1:100 и 1:1000 не оказывали цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека. Учитывая отсутствие морфологических и цитотоксических различий эффекта препарата при разведениях, для исследования биоактивности препарата Meso-Wharton P199™ использовали разведение: 1:10.

Эластин, объем которого составляет всего 2 % от общего объема белков дермы, наряду с коллагеновыми волокнами придает ей упругость и эластичность. К 50-летнему возрасту в большинстве эластических волокон наблюдаются дегенеративные изменения за счет снижения синтеза эластина фибробластами. Поэтому экспрессия фибробластами эластина является одним из основных маркеров старения кожи.

Коллаген – фибриллярный секреторный белок, наиболее распространенный в организме человека. Он образует волокна, переплетающиеся как нити в ткани. Коллаген и эластин формируют волокнистый каркас, в который могут врастать новые клетки, и обеспечивают коже упругость и эластичность, а нарушение их синтеза приводит к потере этих свойств. По морфологии коллаген принято делить на три группы: фибриллярный коллаген: коллагены I, II, III, V типов; сетевидный коллаген – коллаген IV типа, образующий опорную сеть базальных мембран; нитевидный коллаген – коллаген VI типа.

В дерме взрослого человека интерстициальный фибриллярный коллаген (I и III типы) является самой большой фракцией коллагена и составляет 70 % от сухой массы дермы. При этом содержание коллагена I типа составляет 80 %, а III типа – приблизительно 15 % от всего объема коллагена. На протяжении всей жизни человека содержание коллагенов уменьшается примерно на 1 % в год.

Иммуноцитохимическое окрашивание на характерные для фибробластов маркеры в нашем исследовании показало, что экспрессия цитокератина-19 и эластина в культуре дермальных фибробластов человека Р18, отвечающих за упругость и эластичность кожи, увеличивается после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™, по сравнению с контрольной группой (Рис. 4а, б, в).

Монослойные клеточные культуры являются признанной модельной системой, используемой в разработке и исследованиях лекарственных средств. Однако такая 2D-клеточная модель отличается от естественных условий. Обычная адгезивная культура представляет собой растущие двумерным (2D) монослоем клетки на плоской поверхности. Клетки, прикрепленные к искусственной пластиковой или стеклянной подложке, контактируют с другими клетками с образованием межклеточных контактов только в одной плоскости, что препятствует формированию многомерной структуры. Все органы и ткани, включая кожу, имеют трехмерную клеточную организацию, в которой клетки взаимодействуют друг с другом, образуя сложные комплексы контактов с другими клетками и внеклеточным матриксом, формируя таким образом уникальное микроокружение. Поэтому «старение» монослойной культуры фибробластов in vitro во многом сходно, но неполностью эквивалентно старению кожи in vivo. Воспроизвести все возрастные изменения на монослойной культуре в полном объеме не удается. Это приводит исследователей к переводу модельных систем из 2D- в 3D-условия культивирования. Одним из вариантов 3D-клеточных культур являются сфероиды. Они представляют собой трехмерные самоорганизующиеся в силу природных адгезивных свойств сферические кластеры клеток. При формировании сфероидов клетки могут восстановить межклеточные контакты и создать микроокружение, поддерживающее их нативный фенотип. Однако не все клетки могут образовывать сфероиды. Низкодифференцированные клетки человека, включая «незрелые» фибробласты, в условиях отсутствия адгезии способны агрегировать друг с другом, формируя новую многоклеточную структуру – сфероид, содержащий эпителиальный и мезенхимный компоненты. Стареющие культуры фибробластов способность к сфероидообразованию утрачивают. Для сфероидообразования важен определенный уровень экспрессии фибронектина и интегринов α5 и β1 фибробластами. Дифференцировка и последующее старение клеток сопровождаются утратой способности к мезенхимо-эпителиальному переходу, без которого невозможно формирование сфероидов. Таким образом, сфероидообразование является уникальной простой количественной тестовой системой для определения клеточной зрелости и оценки влияния на нее исследуемых препаратов.

Кроме того, 3D-клеточные культуры более стабильны, чем 2D-клеточные культуры. Их можно поддерживать в культуре в течение длительного времени – более 3 месяцев, в отличие от монослойных культур, которые быстро достигают конфлуентного состояния и требуют постоянного пересева или при отсутствии пролиферации («старые» культуры) погибают. Поэтому именно 3D-культуры стали активно использовать при изучении отсроченных эффектов лекарственных препаратов.

На рис. 5 представлена сборка отдельных фотографий на сроках: 12 часов, 24 часа, 3, 5 и 7 суток. Видно, что при сокультивировании культуры фибробластов Р18 с препаратом Meso–Wharton P199™, смешанного с ростовой средой, уже через 12 часов наблюдается образование рыхлого сфероида. В течение последующих дней происходит компактизация клеток и уплотнение сфероида, которое заканчивается к 7 суткам культивирования. В отличие от сфероидов, образованных из фибробластов Р4, размеры образованных сфероидов из фибробластов Р18 через 7 суток немного больше, даже после компактизации. Вероятно, это связано с большим размером клеток в культуре фибробластов Р18. Из культуры фибробластов Р18, культивированных без пептида, через 12 часов образуется рыхлый агрегат, который при дальнейшем культивироании не компактизуется, а остается рыхлым с темной некротической зоной внутри сфероида и рыхлым наружным слоем, состоящим из дебриса. Возможно, клетки не могут синтезировать достаточное количество внеклеточного матрикса для образования межклеточных контактов и последующего образования сфероида.

Рис. 5. Влияние препарата Meso–Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов в условиях 3D-культивирования. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия

Исследование способности образовывать сфероиды показало, что присутствие в ростовой среде препарата Meso-Wharton P199™ стимулирует «омоложение» клеток и последующее восстановление мезенхимо-эпителиальной пластичности культивированных фибробластов за счет восстановленной способности синтезировать в достаточном для установления межклеточных контактов количестве компонентов внеклеточного матрикса (фибронектина и коллагенов), что влияет на способность формировать сфероиды. Результаты иммуноцитохимического исследования сформированных сфероидов, представленные далее, подтвердили наше предположение по восстановлению экспрессии компонентов внеклеточного матрикса. Было показано, что в сфероидах, культивированных в ростовой среде с добавлением препарата, практически все клетки экспрессировали эластин (Рис. 6а, б, в), а поверхностные клетки активно экспрессировали цитокератин-19 –белки внеклеточного матрикса, поддерживающие упругость кожи (Рис. 7а, б, в).

Рис. 6. Экспрессия эластина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)

Рис. 7. Экспрессия цитокератина-19
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)

Препарат не оказывал ключевого влияния на экспрессию коллагенов I и III типов. Практически все клетки сфероидов экспрессировали эти коллагены. Однако при исследовании влияния на экспрессию коллагена IV типа было обнаружено, что после сокультивирования с препаратом р199 практически все клетки в сфероиде экспрессировали этот коллаген. Очевидно, анализируемый препарат активно стимулирует в фибробластах выработку коллагена IV – основного компонента базальной мембраны эпидермиса, дефицит которого приводит к старению кожи и развитию в ней патологических процессов (Рис. 8а, б, в). Также было установлено, что препарат 199 положительно влияет на уровень экспрессии фибронектина (Рис. 9а, б, в), который вместе с гликозаминогликанами составляют аморфный (основной) компонент межклеточного матрикса. Кроме того, фибронектин отвечает за адгезию, подвижность, дифференцировку и взаимную ориентацию клеток (6).

Рис. 8. Экспрессия коллагена IV типа
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso-Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4

Рис. 9. Экспрессия фибронектина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4

Заключение

Результаты данного исследования убедительно продемонстрировали эффективность применения препарата Meso-Wharton P199™ для омоложения кожи.

Источник