Иммунохемилюминесцентным методом что это
Современные возможности технологии хемилюминесцентного анализа в хирургической клинике
Ю.С. Винник, А.А. Савченко, О.В. Теплякова, Е.В. Онзуль, А.И. Дробушевская
ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ им. В.Ф.Войно-Ясенецкого»,
Кафедра общей хирургии
История изучения хемилюминесценции (ХЛ) биологических объектов насчитывает около пяти десятилетий с тех пор, как итальянские астрономы Л.Колли и У.Фаччини обнаружили свечение непигментированных тканей растений. Если в первых работах интерес к ХЛ был связан, в основном, с поисками принципиальных доказательств образования возбужденных и свободнорадикальных состояний в темновых биологических реакциях, то сейчас ХЛ является по существу обычным лабораторным методом, широко используемым в клинике. Успехи в этой области во многом связаны с совершенствованием техники регистрации слабых световых потоков, позволяющей улавливать излучение отдельных клеток и получать микроскопическое изображение свечения [11, 17].
На сегодняшний день химические и физические явления, лежащие в основе превращения энергии биохимических реакций в световое излучение, в основном расшифрованы. Хемилюминесцентная реакция включает следующие основные стадии: а) восстановление одного из участников реакции и окисление второго, приводящее к накоплению химической энергии в системе; б) перенос электрона на один из более высоких энергетических уровней и образование, таким образом, продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии; в) высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция) [2, 3, 19]. Разнообразие реальных механизмов хемилюминесцентных реакций определяется природой и энергетикой отдельных стадий, структурой реагентов, большим числом промежуточных и конечных продуктов.
Сверхслабое свечение или собственное излучение клеток и тканей практически всегда сопровождает процессы жизнедеятельности и может быть обусловлено тремя типами реакций: реакциями активных форм кислорода (АФК), реакциями цепного (перекисного) окисления липидов, реакциями с участием оксида азота [22]. Главным источником АФК в организме человека и животных служат клетки-фагоциты: гранулоциты, моноциты крови и тканевые макрофаги. Непосредственной причиной собственной хемилюминесценции активированных фагоцитов считают образование синглетного кислорода в реакциях между кислородными радикалами, перекисью водорода и гипохлоритом.
Одной из основных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей является свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света (фотон). Увеличение продукции радикалов в системе сопровождается ростом интенсивности ХЛ. Вещества-антиоксиданты, реагирующие со свободными радикалами и тормозящие цепное окисление, одновременно подавляют хемилюминесценцию. При этом подавление собственной хемилюминесценции тканей и клеток антиоксидантами, например токоферолом, указывает на то, что это свечение обусловлено реакциями цепного окисления липидов. С другой стороны, изучая влияние различных природных и синтетических соединений на кинетику ХЛ, можно получать представление о способности этих веществ препятствовать повреждающему действию свободных радикалов [5, 12, 22].
Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, отличается низкой интенсивностью, что явилось основным препятствием на пути к широкому ее использованию в аналитических целях. Значительное распространение получило измерение хемилюминесценции в присутствии активаторов (индукторов). Химическими активаторами (зондами ХЛ) называют соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов. Известными представителями группы химических активаторов являются люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)] [2, 5].
Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. К ним относятся некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов, в том числе родамин Ж, ализариновый красный, конго красный, фуксин кислый, метиленовый голубой, акридиновый оранжевый, некоторые порфирины и редкоземельные металлы. Поиск веществ-активаторов, не оказывающих влияния на ход реакций перекисного окисления, но многократно увеличивающих интенсивность свечения, продолжается в настоящее время.
В широкой клинической практике хемилюминесцентный анализ используется в трех основных вариантах: ХЛ сыворотки крови и других биологических жидкостей, клеточная ХЛ и хемилюминесцентный иммунный анализ.
Индуцированная ХЛ сыворотки крови, по мнению большинства исследователей, является наиболее чувствительным и объективным методом изучения процесса перекисного окисления липидов. Реакции цепного окисления отличаются большой сложностью и включают в себя целый ряд быстропротекающих стадий. Основные участники реакций, свободные радикалы, обычными методами химического анализа определены быть не могут из-за своей крайне высокой реакционной способности и неустойчивости в биохимических системах. Поэтому регистрация интенсивности свечения в режиме реального времени представляет собой ценную информацию для анализа механизма реакций перекисного окисления липидов.
Уровень ХЛ сыворотки крови является отражением подвижного равновесия, объективным интегральным показателем соотношения интенсивности ПОЛ и активности биологических антиоксидантных систем организма. Регистрация ХЛ тканей и биологических жидкостей лежит в основе многообразия методов выявления ранних стадий нарушения защитно-приспособительных реакций организма, диагностики состояния предболезни, определения прогноза и тяжести заболевания, выбора этиопатогенетического воздействия и контроля состояния пациента [1, 11, 15, 18].
Концентрация свободных радикалов в исследуемом объекте определяется по значению максимальной интенсивности сигнала (I max) и светосуммы (S). Антиоксидантный потенциал пробы коррелирует со скоростью падения кривой хемилюминесценции (tg a) и коэффициентом К, определяемым по соотношению I max/S. При острых воспалительных процессах наблюдается увеличение I max и S, при этом степень увеличения пропорциональна тяжести воспалительного процесса. Снижение значений указанных показателей более чем в два раза регистрируется при наличии злокачественных новообразований [5, 13].
Анализ кинетики хемилюминесцентных реакций различных биологических жидкостей (сыворотки крови, мочи, ликвора, слюны, раневого, плеврального и перитонеального экссудата) позволяет осуществлять дифференциальную диагностику неспецифического воспаления и онкологического процесса, функционального и органического поражения. Так, определение интенсивности ХЛ сыворотки крови лежит в основе экспресс-метода дифференциальной диагностики приступа абдоминальной формы периодической болезни и заболеваний, протекающих с картиной «острого живота», и позволяет уменьшить частоту необоснованных хирургических вмешательств [2, 11, 18].
Существенный интерес представляет изучение влияния на ХЛ разнообразных внешних агентов, обладающих как про-, так и антиоксидантным действием. В клинической практике способность антиоксидантов подавлять люцигенинзависимую хемилюминесценцию используется для оценки их количественного содержания в биологическом материале. С другой стороны, анализ интенсивности ХЛ является адекватным критерием эффективности и безопасности антиоксидантной и окислительной терапии [8, 9, 10, 16, 20]. Исследование ХЛ сыворотки крови позволило подтвердить, в частности, эффективность озонотерапии в компенсации свободнорадикального окисления [8, 9, 16, 17].
По мнению Е.В.Иванишкиной и соавт., наиболее информативным хемилюминесцентным показателем контроля эффективности микроволновой резонансной терапии в лечении язвенной болезни является суммарная антиоксидантная активность сыворотки крови. Изучение динамики ХЛ раневого экссудата у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей позволяет прогнозировать скорость процесса репарации и оценить эффективность влияния различных средств местного лечения.
В последнее время, однако, термин «клеточная ХЛ» чаще употребляется в более узком смысле: так называют свечение, сопровождающее продукцию активных форм кислорода клетками-фагоцитами. В основе этого типа клеточной ХЛ лежит образование супероксидного анион-радикала в результате одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода ферментной системой НАДФН-оксидазой. Дальнейшие превращения этого первичного радикала сопровождаются хемилюминесценцией. Высокая чувствительность данного метода, абсолютная безвредность по сравнению с радиоиммунологическим анализом, а также большой научный интерес к деятельности клеток-фагоцитов привели к тому, что число публикаций по данному вопросу ежегодно исчисляется тысячами, а сфера применения метода постоянно растет. ХЛ анализ позволяет исследовать механизмы активации фагоцитов (полиморфноядерных лейкоцитов, тканевых макрофагов), оценить иммунореактивность организма под влиянием иммунодепрессивных и стимулирующих воздействий, выявить недостаточность опсонических факторов сыворотки, в том числе индуцирующихся при активации альтернативного пути комплемента, специфических антител.
Метод регистрации ХЛ клеток крови позволяет проводить изучение и отбор иммуномодулирующих фармакологических препаратов на основании сравнения люминолзависимой стимулированной хемилюминесценции до и после введения в пробу с лейкоцитарной взвесью исследуемых препаратов.
Хемилюминесцентный тест является высокочувствительным и безопасным методом диагностики непереносимости лекарственных средств. В случае непереносимости инкубация цельной крови с раствором этих препаратов в терапевтических концентрациях сопровождается достоверным снижением генерации активных форм кислорода нейтрофилами, стимулированными неспецифическими активаторами. Снижение люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови при непереносимости лекарственного препарата отмечается независимо от химических свойств и принадлежности медикаментов к фармакологическим группам.
Возможности хемилюминометрии значительно расширились после разработки ее модификаций, основанных на хемилюминесцентном иммунном анализе. Для определения содержания в средах организма антигенов, антител и биологически активных веществ используется связывание одного из реагентов с хемилюминесцентной меткой, изменяющей энергетическое состояние во время иммунологической реакции антиген-антитело. Хемилюминесцентной меткой чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение метки производится либо к антигену, т.е. низкомолекулярному соединению (хемилюминесцентный иммунный анализ), либо к антителу на этот антиген (иммунохемилюминометрический анализ). Оба метода направлены на экспресс-определение биологически активных низкомолекулярных соединений (гормонов, антител, лимфокинов и др.) в сверхнизких концентрациях [7, 24].
В заключении необходимо отметить, что анализ данных литературы демонстрирует большие возможности применения хемилюминесцентного анализа в клинико-биохимических лабораториях для целей медицинской диагностики. К перспективам использования метода можно отнести расширение круга изучаемых заболеваний, уточнение патогенеза болезней и прогнозирование их исхода, динамическое наблюдение за эффективностью терапии, определение новых направлений лечебно-профилактического воздействия.
1. Авзалетдинова, А.Р. Хемилюминесценция крови и мочи у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом /А.Р. Авзалетдинова, Р.Р. Фархутдинов, Р.М. Фазлыева // Здравоохранение Башкортостана.- 1994.- №4.- С. 36- 39.
3. Дамбаева, С.В. Оценка продукции активных форм кислорода методом лазерной проточной цитометрии в клетках периферической крови человека / С.В. Дамбаева, Д.В. Мазуров, Б.Г. Пинегин // Иммунология.- 2001.- №6.- С.58- 60.
4. Демин, Д.Б. Прогностическое значение содержания продуктов липопероксидации в тканях при панкреонекрозе / Д.Б. Демин, В.С. Тарасенко, Д.В. Волков // Вестник хирургии.- 2003.- Том 162.- №5.-С. 47-50.
6. Друх, В.М. Метод изучения хемилюминесценции лейкоцитов цельной крови / В.М. Друх // Клин. лаб. диагностика.- 2004.- №12.- С.41.
7. Кондрашова, Е.А. Хемилюминесценция как наиболее чувствительный метод иммуноферментного анализа и его применение / Е.А. Кондрашова, М.Г. Кожанов// Клиническая лабораторная диагностика.- 1999.- №9.- С.32.
9. Коррекция гомеостаза при остром панкреатите методом озонотерапии / М.И. Гульман, Ю.С. Винник, С.В. Миллер и др.//- Красноярск, 2003.-С.179.
10. Кузнецов, Н.А. Результаты применения синтетических антиоксидантов в лечении больных деструктивным панкреатитом / Н.А. Кузнецов, Г.В. Родоман // Хирургия.-2005.-№3.- С.36-39.
12. Меньшикова, Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии.- 1993.- №4.- С. 422- 455.
13. Меньшикова, Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии.- 1997.- №2.- С. 155- 171.
15. Островский, В.К. Оценка тяжести и прогноз гнойно-деструктивных заболеваний органов брюшной полости / В.К. Островский, А.В. Мащенко // Хирургия.- 2007.- №1.- С.33.37.
17. Стежко, Д.В. Новая хемилюминесцентная технология и прибор определения воздействия озона во время проведения сеансов озонотерапии / Д.В. Стежко // Новая технология: Научн. техн. сборник.- 2003.- №1.- С. 21-24.
18. Терехина, Н.А. Хемилюминесцентный анализ биологических жидкостей больных сахарным диабетом / Н.А. Терехина // Клин. лаб. диагностика.- 2004.- №10.- С.20.
Новые методы диагностики COVID-19
Поведение нового коронавируса, который вызывает COVID-19, изучают ученые по всему миру. Совершенствуются методы диагностики, направленные на выявление в организме SARS-CoV-2. В конце 2020 года на рынке лабораторных исследований были представлены более 300 разных тестов:
ПЦР и антиген-тесты позволяют обнаруживать частички коронавируса в организме на момент проведения исследования и указывают на то, что человек может быть потенциальным источником заражения окружающих. Серологические тесты на определение антител (иммуноглобулинов) показывают наличие иммунного ответа организма при встрече с вирусом.
ДИЛА одной из первых частных лабораторий Украины начала тестирование на COVID-19 методом ПЦР и имеет уникальный для Украины экспертный опыт, приобретенный на базе 241 184* проведенных тестов!
Одной из последних разработок стали тесты на определение специфических антигенов вируса SARS-CoV-2. У них есть как преимущества, так и недостатки: они более доступны и результат можно получить прямо на месте тестирования в течение 20 минут. Однако чувствительность этих тестов ниже по сравнению с ПЦР, потому как результат теста на АГ, как правило, напрямую зависит от вирусной нагрузки. Антиген-тесты в мазке из носо-, ротоглотки выявляют белки коронавируса SARS-CoV-2, которые синтезируются в ходе репликации и результат также очень зависим от качества и места взятия материала. На сегодня многие компании по всему миру заняты разработкой тестов для выявления антигенов коронавируса SARS-CoV-2. Однако это исследование имеет свои особенности и ограничения применения. Какие именно, расскажут эксперты ДИЛА.
*данные Центра общественного здоровья МОЗУ состоянием на 01.02.2021 г.
В чем заключаются отличия метода ПЦР и антиген-теста
Метод ПЦР – золотой стандарт диагностики, регламентированный Министерством здравоохранения Украины и рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения для установления наличия/отсутствия возбудителя коронавирусной болезни.
ДИЛА предлагает выбор ПЦР исследований в зависимости от необходимости срока получения результата:
Когда показан ПЦР тест:
Современные возможности ПЦР диагностики позволяют ответить на вопрос: присутствует или нет вирус в данном мазке, а также определить вирусную нагрузку (ВН): как много вирусных частиц в 1 мл исследуемого материала (может быть высокая, средняя, низкая). От показателя ВН напрямую зависит контагиозность (заразность) инфицированного человека для окружающих.
Материалом для ПЦР исследования на определение COVID 19 может служить мокрота, смывы с бронхов, кал
Как определяется ВН и ЧТО означает показатель Сt**.
Для условного определения ВН используют показатель «пороговый цикл», обозначенный в результате анализа как Сt (Сycle threshold). Он показывает, сколько циклов амплификации произошло для достижения порога обнаружения вирусной РНК в образце. С каждым циклом количество копий РНК удваивается. Чем больше вирусных частичек в образце, тем быстрее их выявит тест-система и тем ниже будет показатель Ct.
Обычно ПЦР в реальном времени происходит в течение 40 циклов. После каждого цикла оценивают наличия свечения (флюоресценции), которое исходит от меченых фрагментов РНК возбудителя.
Тест для определения антигена SARS-CoV-2 основан на выявлении в биоматериале специфического белка, который принадлежит нуклеокапсиду коронавируса
Для исследования используется материал тот же, что и в большинстве случаев для проведения ПЦР – соскоб из носо- и ротоглотки. Большим плюсом является то, что результат можно получить на месте уже через 20 минут. Также положительным моментом служит его стоимость – экспресс-тесты более доступны, так как для проведения тестирования не требуется дорогостоящее оборудование, квалифицированный персонал, современные лаборатории.
Тест на антиген способен выявить присутствие COVID-19 в том случае, когда вирусная нагрузка высокая, т.е. в носоглотке находятся сотни тысяч и миллионы копий вируса, что чаще бывает в начале заболевания или в период разгара коронавирусной болезни. При средней или низкой вирусной нагрузке тест может дать ложноотрицательный результат.
В основном экспресс тесты предназначены для «быстрого реагирования»:
Положительный результат теста на антиген при наличии симптомов заболевания свидетельствует о том, что человек болен COVID-19. Однако если результат теста положительный, а проявления отсутствуют, необходимо в течение ближайших двух дней провести ПЦР тест для подтверждения полученных результатов теста на антиген.
Отрицательный тест на антиген не исключает наличие COVID-19:
В данном случае для подтверждения антиген-теста используется ПЦР.
Также данный вид тестирования не рекомендуется для проведения лицам с подозрительным и вероятным случаем COVID-19 без клинических проявлений, у которых количество вирусов в носоглотке может быть небольшим и быстрый АГ тест не сможет их выявить.
Отрицательный тест на антиген не является заключением о выздоровлении после коронавирусной болезни, разрешительным документом для досрочного снятия с самоизоляции в сервисе «Дій вдома» в случае прибытия из стран «красной зоны». В этих случаях также требуется результат ПЦР.
Иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) – методика выявления антител (иммуноглобулинов) IgM и IgG к коронавирусу. В ДИЛА проводится определение:
ИХЛА позволяет подтвердить или исключить факт встречи с вирусом SARS-COV-2 и оценить наличие иммунного ответа к нему. Метод направлен на полуколичественное обнаружение антител, которые указывают на то, что человек сейчас болен COVID-19 (IgM) или переболел ранее к SARS-COV-2 (IgG), а также дает возможность оценить иммунный ответ в динамике.
ИХЛА – метод серологической диагностики, обладающий весомыми преимуществами по сравнению с методом ИФА (иммуноферментный анализ):
ИХЛА исследования показаны:
Суммарное определение антител повышает диагностическую ценность исследования и позволяет определить комбинацию иммуноглобулинов в ходе одного исследования, не привязываясь ко времени инфицирования. Также, в ближайшем будущем благодаря исследованию вы сможете:
Иммуноглобулины (антитела) каждого класса появляются, а затем снижаются ниже порога обнаружения в определенный отрезок времени, который зависит от индивидуальных особенностей организма. Например, антитела могут начать вырабатываться гораздо позже, или если антитела класса М уже снизились ниже порога определения, то прибор определит антитела класса G, и наоборот. В таком случае определение суммарных антител имеет значительные преимущества по сравнению с обнаружением IgG и IgM по отдельности за счет большего временного диапазона определения иммунного ответа и позволяет перекрыть «серологические окна», что значительно повышает чувствительность тест-систем.
Как используются тесты для диагностики COVID-19
Разные тесты служат для разных целей
Исследование на антитела lgM позволяет:
Исследование на антитела lgG позволяет:
Они направлены на прямое определение антигена (нуклеокапсидного белка) SARS-CoV-2 иммунохроматографическим методом в образцах соскобов из носоглотки человека, что позволяет с высокой вероятностью предположить инфицирования вирусом (SARS-CoV-2).
Исследование методом ПЦР позволяет:
Диагностический экспресс-тест – скрининговое исследование, оправданное в условиях ограниченной доступности ПЦР, а также когда продолжительность ожидания результата ПЦР-исследования исключает его клиническую эффективность. Он позволяет непосредственно на месте получить качественную оценку касательно заражения. Поэтому экспресс-тесты уместны, если результаты нужно получить максимально быстро у лиц с подозрительным и вероятным случаем COVID-19. Кроме того, исследование методом полимеразной цепной реакции требуется во всех официальных случаях: при выезде за границу, возвращении из стран с высоким уровнем распространением инфекции с целью досрочного прекращения самоизоляции. Во всех этих случаях в качестве подтверждения отсутствия инфекции SARS-CoV-2 рассматриваются исключительно результаты ПЦР.
Быстрый тест на антиген можно сдать в отдельных отделениях, предварительно заполнив Анкету-направление на сайте
Иммунохемилюминесцентным методом что это
В настоящее время представлено множество моделей автоматических анализаторов, отличающихся по методу, используемому для обнаружения искомого вещества. Основными используемыми методами анализа являются:
Рассмотрим подробней иммунохемилюминесцентный анализ.
Иммунохемилюминесцентный анализ основывается на иммуноферментном методе, принцип которого был разработан в 1971, как замена радиоиммунному анализу, который представлял опасность для здоровья сотрудников лаборатории, проводивших исследования.
Дальнейшее развитие систем анализа использующих ИФА, в том числе их повсеместная автоматизация, привели к появлению разновидностей ИФА, а именно иммунохемилюминесцентному анализу.
Иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) является лабораторным анализом, который сочетает хемилюминесценцию (электромагнитное излучение, вызванное химической реакцией с образованием света) с реакцией образования иммунного комплекса «антиген-антитело». Как и в случае с другими видами иммуноанализа (РИА, ИФА), в ИХЛА используются химические компоненты, которые могут генерировать световое излучение в результате химической реакции, например, меченные антитела. Таким образом, метод обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаружить широкий спектр веществ белковой природы.
ИХЛА бывает двух типов качественный и количественный. В первом случае определяется наличие или отсутствие в анализируемом материале искомого компонента, во втором случает определяется найденная концентрация определяемого компонента в материале. Чаще всего используется количественный тип ИХЛА.
В лабораторной диагностике, с применением ИХЛА, основными видами исследуемых жидкостей организма являются цельная кровь, плазма, сыворотка, моча, спинномозговая жидкость, мазки с слизистых оболочек. Вид используемой в исследовании жидкости определяется используемой моделью анализатора и совместимыми наборами реагентов.
Основные плюсы метода:
— Безопасность для персонала, проводящего исследование;
— Широкий спектр применения;
— Относительная простота используемого оборудования;
— Широкий линейный диапазон.
Основные минусы:
— Дороговизна реагентов и оборудования;
— Интерпретацию результатов должен осуществлять специалист;
— Низкая восприимчивость к инфекционным заболеваниям (большинство используемых реагентов могут лишь косвенно указать на наличие инфекции)
— Лечащему персоналу необходимо знать, какой аналит должен быть найден, при назначении исследования.
В последние годы ИХЛА привлекает все большее внимание в различных областях, включая биологию, клиническую диагностику, мониторинг окружающей среды, безопасность пищевых продуктов и фармацевтический анализ.